透明质酸酶治疗透明质酸动脉栓塞兔耳皮肤缺血性病变的疗效观察

庄岩 刘春军 杨明勇

透明质酸（Hyaluronic acid，HA）是目前使用最为广泛的面部注射填充材料。常见并发症包括淤青、红肿和结节[1]。最严重的并发症莫过于血管栓塞造成的组织缺血[2-3]，栓塞严重或未及时治疗，病灶缺血程度将逐渐加重，并最终出现皮肤软组织坏死、瘢痕形成、面容不同程度损毁[4-11]。除了阻塞于注射点局部的动脉，HA 栓子还能够在注射压力的作用下沿受累动脉逆行，阻塞于视网膜动脉和脑动脉[12-15]。

对于HA 引起的动脉栓塞并发症目前尚缺乏确切和统一的治疗。在条件允许的情况下，溶栓、再通血管治疗是改善急性动脉栓塞组织缺血的最佳方式。传统的溶栓药物（如尿激酶、链激酶等）只能针对性地溶解血栓栓子，尚无证据表明其对HA 栓子有效。在兔耳动脉栓塞模型上，我们尝试在血管内应用透明质酸酶（hyaluronidase，HAase）来溶解HA 栓子，以探索HAase 血管内应用的可行性及其效果。

1 实验对象与方法

1.1 实验动物

成年新西兰大白兔25 只，体质量3.4～3.6 Kg，雌雄不限。分为5 组（每组5 只）：纯栓塞对照组（Control 组）、生理盐水全身静脉溶栓对照组（Intravenous thrombolysis with NaCl,IVT-NaCl 组）、HAase全身静脉溶栓治疗组（Intravenous thrombolysis with HAase,IVT-HAase 组）、生理盐水选择性动脉溶栓对照组（Intra-arterial thrombolysis with NaCl,IATNaCl 组）、HAase 选择性动脉溶栓治疗组（Intra-arterial thrombolysis with HAase,IAT-HAase 组），均行右耳手术，经左耳耳后静脉外侧支或耳前静脉注射荧光素钠进行荧光造影检查。

1.2 试剂与仪器

注射用修饰透明质酸钠凝胶（华煕福瑞达生物医药有限公司），注射用荧光素钠溶液（3 mL/0.6 g，广州白云山明兴制药有限公司），注射用HAase（1 500 U/瓶，上海第一生化药业有限公司）。

气密性Hamilton 100 μL 微量进样器（瑞士Hamilton 公司），365 nm 紫外线手电筒（安富电子有限公司），静脉留置针（24 G×19 mm/Y-G，威海洁瑞医用制品有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 建立兔耳岛状皮瓣HA 动脉栓塞皮肤缺血模型

参照文献[16]，注射20 μL HA 进行动脉栓塞。

1.3.2 全身静脉溶栓治疗

IVT-NaCl 组：将12 mL 生理盐水装在20 mL注射器内并安装在KL-60 注射泵上，在HA 动脉栓塞皮瓣制作完成后40～50 min 经后肢隐静脉给药，给药速度为12 mL/h，连续给药1 h。

IVT-Haase 组：按10 000 U/Kg 计算HAase 给药剂量，并将其溶于12 mL 生理盐水内，给药方式、速度和时间同IVT-NaCl 组。

1.3.3 经颈外动脉选择性溶栓治疗

HA 动脉栓塞皮瓣制作完成后，实验兔仰卧位，颈部备皮消毒，在颈部正中及右侧下颌角水平设计T 形切口；切开并寻找右侧颈总动脉，在舌骨端离断下颌舌骨肌，更好地暴露颞浅下颌干和舌面干；结扎并离断舌面干，结扎点尽量远离颞浅下颌干和舌面干分叉处。动脉夹临时夹闭颈外动脉主干近端、颞浅下颌干远端，之后经舌面干断端插入24 G 静脉留置针并用7-0 聚丙烯缝线结扎固定，静脉留置针针尖位于颈外动脉主干之内。确定无出血后打开动脉夹和输液泵开关，开始给药。可根据情况适当调节插管深度，但针尖不能超过颈内动脉发出水平。

IAT-NaCl 组：直接给以12 mL 生理盐水，给药速度12 mL/h，连续给药1 h。

IAT-HAase 组：按10 000 U/Kg 计算HAase 给药剂量，并将其溶于12 mL 生理盐水内，给药方式、速度和时间同IAT-NaCl 组给药完成后，在舌面干近端预置7-0 聚丙烯缝线，双人操作，在拔出静脉留置针的同时结扎缝线；确定无出血后缝合皮肤，切口涂红霉素药膏。

1.3.4 术后观察

1.3.4.1 大体观察

观察实验兔进食、排泄、体质量等全身状况；观察IVT-NaCl 组和IVT-HAase 组后肢隐静脉穿刺处皮肤情况，以及IAT-NaCl 组和IAT-HAase 组颈部切口情况

1.3.4.2 皮瓣观察

观察皮瓣颜色和肿胀程度，以及皮瓣下有无出血、积液、积脓、皮瓣有无坏死；术后4 h、3 d、7 d 拍照并记录，同时进行FA 检查，观察皮瓣灌注情况。麻醉后20%荧光素钠15 mg/Kg 经左侧耳后静脉外侧支或耳前静脉注射，10 min 后暗室下365 nm 紫外线手电筒照射皮瓣，观察荧光充盈范围和部位，拍照记录。

1.3.5 术中要点及术后注意事项

两种溶栓治疗过程中，均需保证麻醉状态，尤其是选择性动脉溶栓时，麻醉不足可导致插管脱出；分离和暴露颈外动脉及其分支时，可见粗大的迷走神经，不可损伤，否则会影响呼吸运动；分离颈外动脉远端分支时，有舌面干主干缺如的情况，此时可同时结扎并离断舌动脉和面动脉，以保证两种不同的解剖分支情况下，药物最终均进入颞浅下颌干中，无额外的面动脉或舌动脉分流；在掌握颈外动脉分支解剖、双人熟练手术操作的基础上，通常可在HA 动脉栓塞皮瓣制作完成后40～50 min 开始选择性动脉给药治疗。在完成颈外动脉插管后需尽早开启输液泵开关，否则静脉留置针前端可有血栓形成。

1.4 结果评价

观察各组术后4 h、3 d、7 d 皮瓣成活和灌注情况，计算并比较各组术后7 d 皮瓣灌注面积百分比的差异。

1.5 统计学分析

以SPSS16.0 进行单因素方差分析，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 全身状况

每次麻醉苏醒后，实验兔可逐渐恢复饮水、进食和活动，但进食量均少于术前。术后前3 天，IATHAase 组、IAT-NaCl 组进食减少相对明显，体质量下降100～300 g 不等，之后进食情况逐渐改善，术后7 d 基本接近术前水平。其余各组实验白兔全身状况无明显变化。所有实验白兔两便正常，尿液呈黄绿色，具有荧光性。

2.2 隐静脉穿刺处皮肤/颈部切口情况

IVT-NaCl 组、IVT-HAase 组后肢隐静脉穿刺处周围皮肤可见轻度水肿，未见血肿、皮肤坏死发生。IAT-NaCl 组、IAT-HAase 组所有颈部切口愈合良好，无感染和切口裂开发生。

2.3 皮瓣肉眼观察及FA 检查

各术后4 h、3 d、7 d 皮瓣肉眼观察显示：所有皮瓣水肿程度相似，各组均有不同程度的皮瓣下积液出现；术后6 d，IAT-NaCl 组有1 例皮瓣发生切口部分裂开；术后7 d，除IAT-HAase 组的1 例皮瓣完全成活外，其他皮瓣均有不同程度的坏死，坏死灶位于皮瓣的远端或者边缘。

各组术后4 h、3 d、7 d 皮瓣FA 检查结果显示：术后4 h，除IAT-HAase 组的1 例皮瓣荧光充盈均匀、边界清晰外，其他所有皮瓣的荧光均呈现花斑状，边界不清；术后3 d，所有皮瓣近心端荧光充盈均匀、边界清晰；术后7 d，所有皮瓣的灌注范围均大于各自术后3 d 时的检查结果，除IAT-HAase 组的1 例皮瓣100%荧光充盈外，其他皮瓣远端均有不同程度的无灌注区。

2.4 术后7 天各组皮瓣灌注面积百分比比较

术后7 d，Control 组、IVT-NaCl 组、IVT-HAase组、IAT-NaCl 组、IAT-HAase 组皮瓣平均灌注面积百分比分别为（76.54%±6.92%）、（74.08%±9.14%）、（76.94%±6.68%）、（76.95%±8.72%）和（95.47%±3.38%）。其中，IAT-HAase 组皮瓣灌注面积百分比显著高于其他4 组（P＜0.05），其他4 组两两比较均无显著差异（P＞0.05）（图1）。

图1 各组术后各时间点皮瓣观察和FA 检查Fig.1 Flap and FA examination of each group at different time points

3 讨论

血管栓塞造成的组织缺血是HA 注射后最严重的并发症[2-3]，不但会导致患者面容不同程度的损毁，还可能造成视网膜动脉甚至脑血管栓塞[4-15]。虽然，HA 动脉栓塞的发生率低，但因庞大的注射人数和不断上升的趋势，其总体发病例数不容小觑。近年来，该并发症屡见报道，其后果和代价是极为惨痛的。

HAase 亦称为玻璃酸酶，是一种能够降低HA活性、提高组织中液体渗透能力的酶。在整形外科领域，HAase 常用于矫正HA 注射后的各种并发症。HA 填充过度引起皮下肿块或硬结时，局部注射HAase 可使肿块或结节缓解吸收[17]。HA 意外注射进入动脉可引起鼻唇沟、鼻部、眉间、额部等处皮肤缺血甚至坏死[4-8，11，18]。除热敷、按摩、氧疗、扩血管、抗凝等非特异性治疗外[19]，若早期行HAase 局部注射治疗，有可能阻止缺血进展而导致的组织坏死[11，20]。但不同文献对局部注射HAase 缓解皮肤缺血的应用剂量相差甚远。Vartanian 等[21]认为应从5～10 U 开始小剂量使用。Hirsch 等[18]使用的剂量为30 U。Sun 等[11]是将150 U HAase 溶于1 mL 生理盐水中进行注射治疗，严重者使用300 U HAase 溶于2 mL 生理盐水中。DeLorenzi[1]建议尽可能使用大剂量HAase，发生血管栓塞并发症时最大用量可到1 500 U。虽然部分组织缺血情况可以得到改善，但是局部注射的HAase 是跨血管直接溶解了动脉内外源性HA 栓子而改善了组织缺血，还是通过溶解组织基质中的HA 成分、易化了组织养分供给而间接发挥改善组织供血的效应尚不得知。临床上因注射层次深浅不一、血管间存在吻合、血管走行变异等因素，往往很难确定动脉栓塞的准确位置。此外，局部皮下注射HAase 并不适合治疗栓塞部位远离HA 注射点的眼部和脑部动脉栓塞这两种严重的栓塞并发症。上述因素共同限制了HAase 局部注射改善HA 动脉栓塞在组织缺血中的应用。

全身应用HAase 的研究早在上世纪70 年代就有报道，当时主要是静脉给药用于治疗急性心肌梗死[22-27]。通过阻断狗的冠状动脉建立急性心梗模型，Wolf 等[28]发现5 000 U/Kg 的HAase 单次静脉滴注能够降低心肌组织内HA 含量。Nilsson 等[22]证实了HAase 对大鼠梗死心肌的保护作用。Maroko 等[25]采用多次HAase 静脉给药的方式治疗了24 例心梗患者，单次药物剂量为500 U/Kg，证实HAase 能够减轻人心肌缺血性损伤。2000 年，Johnsson 等[29]给予同种异体心脏移植后的大鼠静脉HAase 治疗，最小剂量为5 000 U/Kg·h，单次快速静脉注射并持续静脉滴注2 h，最大使用剂量为20 000 U/Kg·h，单次快速静脉注射并持续静脉滴注4 h，结果发现心肌中HA 和心肌间质含水量明显降低，且使用剂量越大，治疗效果越明显。HAase 心肌保护作用的机制主要包括减轻心肌水肿、通过解聚黏多糖增加营养物质流入缺血区、促进有害代谢物流出、保留心肌血流、对微血管的直接保护作用[23]。

HAase 静脉使用具有良好的药物安全性[25，30]。以狗和兔子为研究对象时，快速静脉注射HAase 500 U/Kg，每日6 次，连续2 周，脑、心肌及瓣膜、肺、大动脉、肝脏、脾、性腺、眼、晶体、椎间盘，组织病理学检查均未见异常。健康人静脉注射HAase 500 U/Kg，每日5 次，连续48 h，亦未见临床并发症，生命体征、血磷酸肌酸激酶、乳酸脱氢酶、谷-草转氨酶、血电解质、胆红素、尿素氮、尿液分析、血常规、心电图和胸片检查均未见异常[25]。

Seifter 等[30]指出，静脉注射HAase 后5 min，血中HAase 水平达到峰值，30 min 时活性降低一半，60 min 后无法检测到HAase。Wolf 等[31]发现，静脉注射的HAase 在人、狗、大鼠的循环中半衰期均小于10 min。实验狗结果显示，500 U/Kg 和5 000 U/Kg组血清HAase 活性分别在给药后10 min 和45 min下降到无法检出的水平。血浆HAase 活性降低是物理性排泄清除的结果，而非酶的活性受到抑制或失活。上述两项药物代谢动力学研究结果说明，HAase在循环中将被迅速清除，重复静脉注射并不能使血浆HAase 浓度持续升高。

基于HAase 静脉使用的可行性和安全性，本研究首先进行了HAase 全身静脉给药溶栓的研究。虽然国内外尚无HAase 静脉滴注治疗外源性交联型HA 的报道，但考虑到HAase 在循环中的半衰期非常短，为了保证HAase 可以更好地发挥溶栓作用，必须保证足够的药物浓度和给药时间。因此，本研究采用连续输液1 h 的给药方式，并设定了较高的给药剂量10 000 U/Kg（1 只3.6 Kg 的实验白兔需24支HAase）。遗憾的是，Control 组、IVT-NaCl 组、IVTHAase 组术后7 d 时皮瓣灌注面积百分比并无显著性差异，也就是说在单次剂量10 000 U/Kg、连续静脉给药1 h 的情况下，HAase 并没有显示出溶栓作用。为了进一步验证HAase 的溶栓作用，在给药方式不变的情况下，需要继续提高给药剂量，但随之而来的是可能伴发的药物副作用。此外，研究进行过程中，HAase 采购形势严峻，一药难求，也限制了继续提高药物剂量进行静脉溶栓的可行性。

全身静脉溶栓时，药物首先经下腔静脉回心，再经左心进入主动脉，只有很少一部分HAase 经右侧颈外动脉最终进入到右侧耳郭后动脉，即HA 动脉栓塞的部位，因此绝大部分药物并未在HA 动脉栓塞处发挥作用。HAase 在循环中半衰期短，经过若干个体循环再次回心并进入耳郭后动脉的HAase 活性已经开始降低，溶栓作用进一步变弱。对于血栓栓塞的病例，临床研究已经证实选择性动脉溶栓的效果明显优于静脉溶栓[32-33]。因此，在HAase 半衰期短、全身静脉溶栓无效、药品数量有限的情况下，本研究变换了给药方式，从静脉溶栓转换为选择性动脉溶栓，通过提高局部药物浓度验证HAase 的溶栓作用。有关HAase 动脉应用的研究，此前尚未见相关文献报道。

制作HA 动脉栓塞皮肤缺血模型时栓塞的耳郭后动脉系颞浅动脉的主要分支，后者系颈外动脉的分支之一，故可以经颈外动脉注射HAase 进行选择性动脉溶栓效果的研究。在不具备数字减影血管造影设备和研究经费有限的情况下，本研究选择通过颈外动脉的其他分支（舌面干/舌动脉/面动脉）向颈外动脉置管给药，进行选择性动脉溶栓。

术后7 d，IAT-NaCl 组和Control 组相比，皮瓣灌注面积百分比无统计学差异，也就是说颈外动脉置管、局部给药所造成的血流动力学改变并未影响到皮瓣的灌注。而IAT-HAase 组皮瓣灌注面积百分比显著高于Control 组、IVT-NaCl 组、IVT-HAase组、IAT-NaCl 组，充分证明了HAase 选择性动脉溶栓治疗的有效性。

HAase 在循环中的半衰期非常短，从理论上讲主要在早期发挥溶解HA 栓子的效应，但术后4 h FA 检查荧光边界不清、很难计算皮瓣灌注面积。有关HAase 动脉溶栓的机制，我们推测始动环节是局部高浓度的HAase 直接溶解了部分HA，进而产生以下几方面的后续效应：①直接减少了栓子数量、缩小了缺血组织的范围；②栓子数量减少可以减轻动脉的扩张，从而减少对血管内皮造成的影响；③降低了栓塞动脉内的压力、提高了动脉灌注压，有利于组织再灌注；④栓子中非交联的HA 成分被溶解后，交联的HA 颗粒间可能会出现微小空隙，有利于HA在动脉内重新分布，并为血液和氧的弥散创造可能的空间；⑤即便不能够被充分溶解，但部分交联的HA 颗粒可能在HAase 的作用下变小，有助其通过微循环或者动静脉吻合，甚至通过静脉回流被带出缺血皮瓣。其他可能的机制还包括HAase 跨血管溶解了组织中的HA、减轻了皮瓣水肿、进而改善了循环，HAase 对微血管的直接保护作用等[23]。本研究采用岛状皮瓣验证HAase 血管内应用的溶栓效果，HAase 进入缺血皮瓣的途径仅为阻塞的单一动脉。若采用的皮瓣为非岛状皮瓣，将有更多HAase 被带入缺血区，HAase 有可能会发挥更好的溶栓效果。

本研究初步证实了HAase 选择性动脉溶栓的有效性，为医源性HA 动脉栓塞寻找了新的治疗可能，该方法不但可用于改善皮肤软组织缺血，还有望治疗眼动脉和脑动脉栓塞这两种更为严重的HA 动脉栓塞并发症。

本研究的局限性：①样本观察量小；②仅采用了单一剂量的单次治疗，并未进行不同剂量HAase 溶栓效果的比较观察；③由于HAase 对不同性状（单相或双相，交联或非交联型）、不同交联度、不同生产工艺的HA 产品分解能力不同，本研究结果并不能用于其他剂型的HA 产品。无论是静脉全身溶栓，还是选择性动脉溶栓，均属于HAase 商品标识外用药（超适应证、超用药途径），且研究中HAase 使用剂量远大于Maroko 等用来评价药物安全性的剂量[25]，后续研究还需进一步评价此剂量使用的安全性，尤其需要警惕大剂量使用时过敏的风险。