三磷酸腺苷对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的影响及机制研究

雷杰 何承建 贺梦吟

骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有多向分化潜能[1-4]。研究表明，BMSCs 诱导分化的软骨细胞可治疗软骨损伤[5]。而ATP 可诱导BMSCs 向软骨细胞分化[6-7]。但其作用机制尚未明确。ATP 主要作用于细胞上的嘌呤受体，嘌呤受体又分为P2X 和P2Y 两大类[8]。激活P2X 受体具有促进骨形成的作用[9]，而激活P2Y受体则具有抑制骨形成的作用[10]。因此，本研究采用ATP 诱导BMSCs 分化为软骨细胞，检测软骨细胞中相关mRNA 的表达，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

DMEM 低糖完全培养基（美国Hyclone 公司），胎牛血清、胰蛋白酶、反转录酶（美国Thermo Fisher Scientific 公司），反转录聚合酶链反应试剂（北京博大泰克生物基因技术有限责任公司），SYBR Green Real Time 试剂（上海起发实验试剂有限公司），ATP（西安通泽生物科技有限责任公司），考马斯亮蓝G（北京索莱宝科技有限公司），碱性磷酸酶试剂盒（上海钰博生物科技有限公司）。

MA-680 实时荧光定量PCR 仪、Multiskan GO酶标仪、Applie Biosystems-PCR 仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司），Invitrogen 凝胶成像系统（美国英杰生命技术有限公司），岛津UV-2600 紫外可见分光光度计（日本岛津仪器有限公司）。

1.2 实验动物

4～5 周龄SD 大鼠6 只，体质量80～100 g，雌雄不限（北京维通利华实验动物技术有限公司），实验动物许可证号：SCXK（京）2016-0006。

1.3 实验方法

1.3.1 BMSCs 的分离和培养

大鼠脱颈椎处死后，75%乙醇浸泡10 min，无菌操作台上分离两侧股骨，以含10%胎牛血清DMEM低糖完全培养基10 mL 冲洗骨髓腔。反复吹打混匀骨髓细胞悬液，调整细胞浓度为5×105cells/mL，接种于50 mL 培养瓶中，置于含5%CO2培养箱中培养。接种6 h 后首次换液，以后2～3 d 换液一次。培养7～10 d 后，BMSCs 铺满培养瓶时倒置显微镜观察，以0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.3.2 碱性磷酸酶检测

取第3 代BMSCs，胰酶消化，调整细胞密度为1×105个/孔接种于6 孔板中。设对照组和3 个不同浓度ATP 组，每组3 个复孔。培养12 h 细胞贴壁后，ATP 组加入含有不同浓度ATP（150 μmol/L、300 μmol/L 及600 μmol/L）的培养基，对照组则使用不含ATP 的培养基。继续培养3 d 后，弃培养基，采用4 ℃PBS 冲洗2 遍；每孔加入细胞裂解液80 μL，反复吹打裂解细胞；取96 孔板，分别加入碱性磷酸酶试剂盒溶液100 μL，后加入细胞裂解产物20 μL；室温下孵育30 min 后测定405 nm 处吸光度值。

为研究P2X7 受体在ATP 促进BMSCs 成软骨分化中的作用，在BMSCs 悬液加入ATP（300 μmol/L）的同时加入P2X7 受体抑制剂BBG（1 μmol/L），或单纯加入BBG（1 μmol/L），培养10 d，对BMSCs 中碱性磷酸酶的表达进行检测。

1.3.3 RT-PCR 和实时定量PCR 检测ATP 对BMSCs 成软骨分化的影响

取第3 代BMSCs，接种于12 孔板中，调整密度为3×105cells/mL，分为对照组、ATP 组和成软骨诱导培养组，每组设置3 个复孔，成软骨诱导培养组为阳性对照。待细胞贴壁生长后，分别使用普通培养基（含10%FBS 的DMEM 培养基）、ATP 培养基（含10%FBS 的DMEM 培养基+ATP 300 μmol/L）及成软骨诱导培养基（将含有10%小牛血清DMEM 低糖完全培养基中加入0.05 mmol/L 抗坏血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油及100 nmol/L 地塞米松即为成软骨诱导培养基）。培养3 d 后收集各孔细胞，加入裂解液提取总RNA，进行反转录、PCR、2%琼脂糖凝胶电泳，采用Invitrogen 凝胶成像系统进行成像分析（表1）。

取第3 代BMSCs 接种于12 孔板中，调整密度为3×105cells/mL，分为对照组、ATP 组和ATP+BBG组（每组3 个复孔）。前两组同上，ATP+BBG 组以含有ATP 和BBG 的培养基（含10%FBS 的DMEM 培养基+300 μmol/L ATP +1μmol/L BBG）培养。3 d 后收集各孔细胞，进行实时定量PCR 分析，采用SYBR Green Real Time 试剂反应体系，检测成软骨相关基因SOX6、Sox9、COL1A2 等的相对表达量（表1）。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 BMSCs 镜下观察及RT-PCR 检测P2X7 受体表达

首次更换培养基后10 d，倒置显微镜观察显示BMSCs 呈梭形或多边形；对P2Y2 和P2X7 受体表达检测显示,BMSCs 上存在嘌呤受体，P2Y2 和P2X7均有表达，但P2X7 表达更高（图1）。

图1 BMSCs 镜下观察及P2X7 受体表达Fig.1 Microscopic observation of BMSCs and expression of P2X7 receptor

2.2 ATP 对BMSCs 碱性磷酸酶表达的影响

不同浓度ATP 处理BMSCs 3 d 后，采用碱性磷酸酶试剂盒对BMSCs 碱性磷酸酶表达情况的检测结果显示，ATP 处理后BMSCs 碱性磷酸酶表达显著升高，其中ATP 浓度为150 μmol/L 和300 μmol/L时碱性磷酸酶表达量最高（P＜0.05），两种浓度组间对比无统计学差异（P＞0.05）。因此，后续研究均采用300 μmol/L 为ATP 效应浓度（图2）。

图2 ATP 对BMSCs 碱性磷酸酶表达的影响Fig.2 Effect of ATP on the expression of alkaline phosphatase in BMSCs

2.3 ATP 对BMSCs 成软骨指标表达的影响

RT-PCR 检测ATP 处理3 d 后的BMSCs 成软骨指标，成软骨诱导培养组为阳性对照。结果表明，ATP 可促进多个成软骨指标表达上升，但与阳性对照相比效果较弱（图3）。

图3 ATP 对BMSCs 成软骨指标表达的影响Fig.3 Effect of ATP on the expression of cartilage indexes of BMSCs

2.4 BBG 抑制ATP 对BMSCs 促分化作用

加入BBG 阻断P2X7 受体后，ATP 对碱性磷酸酶的促进作用降低，而BBG 对碱性磷酸酶表达亦无促进作用（图4）。

图4 BBG 对ATP 促碱性磷酸酶表达的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of BBG on the promoting effect of ATP on alkaline phosphatase expression

Real-time PCR 结果显示，ATP 促进BMSCs 中SOX6、SOX9 及COL2A1 的表达，加入P2X7 抑制剂BBG（1 μmol/L）后，ATP 对BMSCs 成软骨指标表达的促进作用明显降低（P＜0.05）（图5）。

图5 BBG 对ATP 促成软骨指标表达的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of BBG on the promoting effect of ATP on cartilage-related indexes

3 讨论

本研究结果表明，一定浓度的ATP 对BMSCs碱性磷酸酶的表达具有促进作用，可促进成软骨相关指标SOX6、SOX9 及COL2A1 等的表达；同时，ATP 对BMSCs 的促软骨分化作用与P2X7 受体具有密切相关性，对P2X7 受体采用BBG 阻断后，ATP的促进作用明显降低，表明ATP 对BMSCs 的促软骨分化作用可能是通过介导P2X7 受体而发挥作用。

碱性磷酸酶为BMSCs 成软骨分化的早期指标，其表达水平增加提示BMSCs 向软骨方向分化[11]。SOX6、SOX9、COL1A2 等都为促进成软骨分化的重要基因[12-14]。SOX6 为BMSCs 成软骨分化的重要标志蛋白质[15]，其表达水平增加提示ATP 具有促进BMSCs 成软骨分化的作用。

研究发现，在力学作用的刺激下软骨细胞释放大量ATP，ATP 除具有直接功能外，还具有信号转导的作用[16-17]。ATP 可与其受体结合发挥生物学作用，其主要受体为P2X 和P2Y 两类。P2X 受体激活对成软骨具有明显的促进作用[9]，而P2Y 受体激活则表现为抑制成软骨作用[10]。受体激活主要与ATP 浓度相关。本研究结果显示，阻断P2X 受体后，ATP 促BMSCs 成软骨分化作用明显降低，表明ATP 可能是通过介导P2X7 受体发挥其促骨髓间充质干细胞成软骨分化作用。Zimmermann 等[18]研究发现，ATP 具有促进软骨细胞释放PGE2，促进软骨细胞钙离子内流等作用。Potucek 等[19]的研究表明，ATP 可激活小胶质细胞丝裂原活化蛋白激酶信号通路。但ATP是否通过激活信号通路促进BMSCs 向软骨细胞分化尚需深入研究。

综上所述，一定浓度的ATP 对BMSCs 向软骨细胞分化具有促进作用，可能是通过介导P2X7 受体而发挥作用。