雌性生殖干细胞的研究进展

黎婷 张海燕

雌性生殖干细胞的研究进展

黎婷 张海燕

(芜湖职业技术学院生物工程学院，安徽芜湖，241000)

生殖干细胞在雄性生物终生的配子形成过程中发挥作用，但只在部分无脊椎雌性生物（如果蝇）和低等脊椎雌性动物（如硬骨鱼和部分猿猴亚目的猴）中的配子形成过程中可见。多年来传统的生殖生物学观念认为，雌性哺乳动物出生后卵巢中并没有卵子发生的能力，出生时卵泡的数量和其随后不断减少的速率决定了雌性生殖动物的生殖寿命。然而近期研究显示，在小鼠、大鼠等多种哺乳动物出生后的卵巢中成功分离和培养了雌性生殖干细胞（Femle Germline Stem Cells，FGSCs）。更有科研团队，利用FGSCs诱导不孕母鼠怀孕并产生正常后代，或者将人的FGSCs移植到小鼠后获得了原始卵泡。如果成年女性卵巢中确实存在FGSCs，那么更年期的发生并不是因为有限数目的卵子的耗尽，而是因为FGSCs和体细胞的老化。因此，FGSCs在基础研究和临床治疗中有巨大的研究价值和应用前景，将为治疗卵巢功能衰退、不孕不育以及延缓女性衰老发挥重要作用。

哺乳动物；雌性；生殖干细胞。

引言

干细胞是一类原始未分化、拥有多潜能性和自我复制能力的细胞，在不同的发育阶段可分为胚胎干细胞和成年干细胞，成年干细胞分为躯体干细胞和原始生殖细胞。一般认为，雌性脊椎动物大部分是由胚胎期的囊胚形成原始生殖细胞，通过变形运动，逐渐经过卵黄囊、尿囊到达生殖脊，和部分中胚层共同形成卵巢。在各信号通路的调控下，原始生殖细胞分化成卵原细胞，卵原细胞通过有丝分裂迅速增殖，并迁移到卵巢皮质。最终卵原细胞进入减数分裂，分化成初级卵母细胞。这些初级卵母细胞表面环绕了颗粒细胞后形成原始卵泡，只有一小部分原始卵泡能够最终发育为成熟卵泡并排出[1]。

生殖干细胞特别之处在于是能够产生具有生殖功能的配子细胞，早在一个世纪之前，致力于研究精子发生的Reguad就假设了在睾丸中必然有能够保持分化的细胞，而这种细胞早就被证实为是雄性生殖干细胞，在雄性哺乳动物睾丸中能够持续增殖、分化，从而维持精子发生，所以雄性动物的生殖年限要长于雌性动物[2]。虽然在一些非哺乳动物中确实发现了FGSCs，但是哺乳动物中是否存在FGSCs仍存在争议[3-4]。传统观念认为，雌性哺乳动物在出生时卵巢中储备了定量的不具备增殖能力的生殖细胞，这些细胞随着年龄增长被耗尽[5]。然而自2004年起，越来越多的研究结果与这一传统生殖生物学传统观念相悖，矛盾的中心围绕FGSCs是否存在和分离方法是否有效，这些细胞在成年哺乳动物体内的作用的生理学作用仍然有待研究。卵母细胞发育、成熟直至能够受精是一个多方面调控的复杂过程，需要对减数分裂和正确的基因组印记进行及时调控[6]，包括亲代等位基因DNA甲基化的表观调控等。故而今后涉及哺乳动物FGSCs体外培养和成熟过程中，关于调控的研究必须完整和正确才能确保临床的可应用性。

1. 非哺乳动物中的FGSCs

研究表明，一些动物出生后卵巢中卵子的数量确实是靠FGSCs分化补充，比如果蝇属中的果蝇，能够在果蝇属卵巢管头端的一个特殊生殖细胞龛里有效分离出少量原始生殖细胞（Primordial Germline Cells，PGCs）[7]。在出生后，这个生殖细胞龛就会控制FGSCs的分化和新的卵母细胞的产生，从而为整个繁殖期源源不断的提供生殖细胞。在硬骨鱼中的青鳉和斑马鱼的卵巢中也发现了这个生殖细胞龛，位于卵巢干上，而且在这个位置发现了具有FGSCs特性并进行减数分裂的细胞，可以持续供给卵巢新的卵母细胞[8]。在这些鱼类和果蝇的整个繁殖期，这种卵子发生的方式才能产生大量卵子，相对于哺乳动物严格的卵子发生和卵泡发育过程，更类似于精子发生的过程。

2. 哺乳动物中的FGSCs

在2004年之前，普遍认为成年哺乳动物中缺乏FGSCs，但蜂猴目中有两个家族，原猴亚目和狐猴，被报道在卵巢皮质“龛”中存在进行减数分裂的生殖细胞[9-10]，并且能够经历卵泡发生从而产生成熟的卵母细胞。如果这些动物中确实鉴定出了FGSCs，那其它雌性哺乳动物中为什么不能存在FGSCs？接下来在成年小鼠闭锁的卵泡中发现了这个传说中的FGSCs[11]，说明成年小鼠有新的卵子发生来填充已经闭锁的卵泡，从而维持整个生殖期的需要。研究发现成年小鼠一天产生77个原始卵泡，在卵巢上皮中就发现了少量有丝分裂的卵圆形细胞，而且表达生殖细胞特异性蛋白MVH，甚至把一块野生型小鼠的卵巢皮质移植到特异性表达GFP的转基因小鼠卵巢中，3-4周后GFP阳性的卵泡周围就有野生型体细胞，这说明具有增殖能力的细胞就位于卵巢皮质中，才能持续进行卵子发生[12]。

接着Zou利用流式细胞仪，选用特异性抗体如DDX4、IFITM3等，分选了一些直径为12-20μm的细胞，这些细胞同时表达多潜能性细胞和生殖细胞的标记物，并具有正常的染色体组型，他们用GFP标记了FGSCs后并将其移植到野生型小鼠卵巢，产生了GFP阳性后代，说明了FGSCs具有进行卵子发生的能力[13]。越来越多的团队利用不同的分离技术获得了出了FGSCs，而人类的FGSCs是在2012年由White首次分离获得，由White及其团队利用荧光活化细胞分选方法分离出小鼠和人类的FGSCs，直径为5-8μm，虽不同于Zou及其团队分离的FGSCs，但是表达相似的生殖细胞标记物，这些细胞的比例非常小，小鼠卵巢中约占0.014%±0.002%[14]。这些FGSCs在体外培养时会产生卵子样细胞，并且表达卵母细胞特异性标记物和有丝分裂标记物，用GFP+的FGSCs后移植到GFP-的小鼠卵巢皮质中，会得到包围着野生型颗粒细胞而GFP+的原始卵泡[15]。尽管利用不同的方法，分出获得的细胞大小不一，越来越多的团队证实在卵巢中分离出了FGSCs细胞群。

3. FGSCs与更年期

如果卵巢在成年期确实有制造新的卵子的能力，那问题就来了：为什么女性会有更年期？因为传统观念认为当有限的卵子耗尽，女性就进入更年期，如果当成年期卵子发生确实发生，新卵子的产生应当会阻止更年期的到来。目前推断了两个机制：FGSCs并不能产生卵子，或者是体环境并不支持卵子发育[16-17]。可能FGSCs和其它体细胞一样会老化，会凋亡，从而失去了再生和分化的能力。果蝇到老龄时，新卵子的产生也大大减少，和FGSCs分化速率减慢和卵子发育时的细胞凋亡有关[18]。也有研究证实，生殖细胞某些细胞因子的年龄依赖性退化，可能会影响FGSCs再生的能力，包括BMP蛋白、E黏蛋白等细胞因子的减少[19]。哺乳动物的老化也可能归因于干细胞的衰老，造血、神经和肌肉干细胞功能都随着老化而下降[20]。Pacchiarotti发现随着小鼠年龄的增长，从卵巢中可分离的FGSCs数量减少[21]。还有研究发现，只有把老龄小鼠FGSCs移植到年轻小鼠的卵巢中，才能进行卵泡生成，这意味着围绕着卵巢的细胞和微环境对于FGSCs在维持女性生殖功能中也发挥着重要作用[22]。但是由于缺乏FGSCs对于出生后卵泡形成的功能和在生理条件下的受孕的关键证明，对于FGSCs还是很有争议，因为以上研究都是实验室条件下获得的，和自然条件下卵巢的功能没有任何相关性。

但是无论是基础研究还是临床应用，FGSCs应用的潜力很大，FGSCs可以作为研究卵子发育和成熟的模型。如Park利用成年小鼠的FGSCs研究BMP4的功能，体外培养FGSCs特异性添加BMP4，不仅FGSCs分化成具有卵子样结构细胞的比例更高，和减数分裂起始相关基因的表达也提高了[23]。Zhang利用GFP-FGSCs移植到野生型小鼠后，不仅获得了荧光小鼠后代，还利用基因敲除技术获得了基因缺失小鼠，从而研究基因的功能[24]。在临床应用中，FGSCs也有很大的应用空间，但是受当下技术条件等因素影响，但是在保留生殖可能和逆转生殖衰老等方面都有可能发挥巨大的作用。当患有癌症的女性需要进行化疗或者放疗前，可以提前保留一块卵巢皮质，把FGSCs分离出来，在需要时进行试管受精，或者体内移植而自然受孕。

4. 展望

卵巢是女性重要的内分泌和生殖器官，不仅可以分泌雌、孕激素，维持女性特征和心理健康，还可以产生卵子，赋予女性生育能力。FGSCs的报道激发了更多生殖学专家的研究兴趣，因为越来越多的研究显示了FGSCs在体外分离培养以及卵子发生的能力。尽管FGSCs的生理学功能还没揭示，关于体外培养时卵子发生也备受质疑，但是FGSCs的应用前景十分巨大，研究卵子发育和临床应用的意义在于提出了新的非激素治疗方法的可能，以期更加安全有效的修复卵巢损伤和重建卵巢功能，减缓卵巢衰老，也可以作为种子细胞，在优良品种的开发和濒危动物的保种中发挥作用，具有极大的临床应用价值。

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Progress of Research on Female Germline Stem

LI Ting & ZHANG Hai-yan

Germline stem cells (GSCs) play a role in gametogenesis in males, but only seen in gametogenesis of some female invertebrates and lower vertebrates. The conventional viewpoint is that female mammals have no ability of generate new germ cells in their ovaries after birth, and their productive life span depends on the number of follicles and their subsequent decreasing rate. However, recent studies show that researchers have successfully isolated and cultured a type of germ cell from postnatal ovaries in a variety of mammalian species. Even some research teams have made infertile mice pregnant induced by female germline stem cells (FGSCs) and obtained normal offspring, or obtain original follicles by transplanting human FGSCs into the bodies of mice. If there are FGSCs literally in the ovaries of adult females, the occurrence of menopause is caused by aging of FGSCs and somatic cells instead of by the exhaustion of limited supply of eggs. Therefore, FGSCs are of great researching values to and have application prospects in basic research and clinical treatment, and will play an important role in treatment for ovarian failure and infertility as well as female anti-aging.

mammal; female; germline stem cells.

Q813

A

1009-1114（2019）02-0027-03

2019-04-09

黎婷（1984—），女，安徽芜湖人，博士研究生，讲师，研究方向为转基因分子育种和去细胞生物工程材料。

研究项目：安徽省自然科学研究重点项目（KJ2018A0691）；芜湖职业技术学院校级人才项目（wzyrc201801）

文稿责编 汤强