微粒子化学发光检测体系的研发介绍

孙梅 刘鹏 耿建利 王晓伟 姚继承 王明义

1.大连医科大学附属威海市立医院中心实验室，山东威海 264200；2.大连医科大学附属威海市立医院肝胆外科，山东威海 264200；3.威海威高生物科技有限公司，山东威海 264200

化学发光免疫检测法是目前检测抗原、半抗原及抗体的主流方式，灵敏度、特异性高的特点使其可用于肿瘤标志物、激素等微量物质的超微定量及定性分析。因此，在各级医疗机构中全自动化学发光检测仪应用普遍。实验室对全自动化学发光检测仪的临床性能要求也不断提高。化学发光体系的设计与应用是发展化学发光技术的前提。国外对于化学发光体系的研究与应用已经相当成熟，通过实现与高效液相 色谱、毛细管电泳、生化免疫分析、电化学分析等技术的联合应用可解决化学发光分析固有选择性差这一难题，使化学发光分析灵敏度更高、结果更准确。但我国国产仪器与国外同类产品在性能上还有一定差距，因此，提高核心科学技术的整体水平而推动国内自动化仪器的发展是必然趋势。微粒子化学发光检测体系作为化学发光检测仪的重要模块，其关键技术水平也在不断优化。本文以新一代国产免疫分析仪AutolumiS 3000的微粒子化学发光检测体系为例，对微粒子化学发光检测体系进行介绍。

化学发光试剂的研究应用及发展是推动化学发光分析技术进步的基础。目前化学发光试剂的种类有很多，包括鲁米诺类、吖啶酯类、过氧草酸酯类和1，2-二氧杂环丁烷类等，鲁米诺类发光效率高、结构稳定且无毒的特点使其成为化学发光试剂的代表性物质之一，在免疫分析或非免疫分析诊断、检测技术和生物传感器等领域有着广泛的应用。

1 免疫复合物形成

鲁米诺类是目前化学发光体系中应用最为广泛的化学发光试剂。异鲁米诺发光效率虽较鲁米诺差，但异鲁米诺做为一种标记物,被标记到抗原或抗体上时,它的发光效率则显著增加。结合异鲁米诺反应时间短、背景噪声低、可直接标记抗原或抗体且结合稳定的特点，AutolumiS 3000的微粒子化学发光检测体系选用异鲁米诺作为直接发光试剂。在免疫反应过程中，以抗原或抗体异鲁米诺发光标记物为示踪信号，以偶联抗原或抗体的磁性微粒子为载体，增大反应表面积，与待测物在均相中反应，形成“夹心”免疫复合物。

2 免疫复合物无损磁性分离

2.1 微米级别的磁性微粒

AutolumiS 3000的微粒子化学发光检测体系采用微米级别的Fe3O4核心的磁微粒为固相载体—磁性微粒表面积大，蛋白吸附能力极强，与包被管或包被珠相比反应表面积增大50倍，是目前最理想的免疫固相分离载体之一。磁微粒增进了结合动力并保证了较大的敏感度。分散悬浮液的反应速率接近均相溶液的动力学，同時抗原抗体的相对反应浓度增高，增快了捕捉的有效性，提高了精确度，加快了免疫反应的速度。

图2 仪器洗涤区磁分离结构示意图

2.2 磁场磁性分离技术

通过对复合物颗粒磁分离过程的分析，给出了磁场设计原则（按图1从小到大依次为16S、15N、14S、13N…顺序排列）。免疫复合物充分无损分离技术（磁场磁性分离技术）的分离共分为三个过程，即吸附过程、冲洗过程和吸走过程。磁铁吸附住磁微粒，能更有效的将游离相和结合相分离。将未结合的抗原和标记物洗涤清除，实现了免疫复合物颗粒快速充分无损分离。

AutolumiS 3000仪器磁分离模块结构示意图（如图2）。磁场作用原理：反应杯中的免疫复合物所处的环境可以视为磁流体，在外加磁场的作用下，液体中的免疫复合物被磁化靠近永磁体，吸附在反应杯壁上，而未与发光标记物结合的颗粒则仍然在反应杯中间位置通过冲洗过程和吸走过程，只留下结合的免疫复合物，从而实现复合物颗粒磁分离过程。

磁场的作用是将复合颗粒束缚在反应杯中，但是又不能使复合物聚集结团，为避免这一情况发生采用圆形的磁铁。在磁分离过程中，外加磁场位于反应器皿的侧面吸附前复合物颗粒均匀分散在反应杯中，吸附后附着在反应杯的侧壁，反应杯吸附过程如图3所示。

图3 反应杯吸附过程示意图

3 异鲁米诺化学发光

异鲁米诺化学发光已经广泛应用于环境、医药、生命科学等领域中有机物及无机物的检测。其发光机理是在碱性环境中下，异鲁米诺被氧化剂H2O2氧化而处于激发态，当其返回到基态过程中发出光子，从而获得闪光信号，如图4所示。为保证反应充分彻底，使测量结果准确可靠，必须实现全部复合物颗粒与激发液的充分接触。因此，通过直针与弯针形式的洗涤针（如图5所示），在激发液加注前的洗涤过程中通过直针将反应杯底部的复合物颗粒团冲开，弯针将贴附在杯壁上的复合物颗粒冲下，防止复合物颗粒聚集成团，保证未结合颗粒全部吸走。

图4 异鲁米诺化学发光原理图

图5 洗涤针中直针、弯针设计

4 微弱闪光信号精确测量

为实现信号的精确测量，研制出微弱闪光信号精确测量技术系统，AutolumiS 3000测量室结构如图6所示。该系统设有严格避光的暗室环境（如图7所示）。反应杯进入反应杯通道，传送到反应杯第一孔加注激发液位置，挡光板关闭，通过测量室升降动作，控制玻璃关门打开，加注激发液并测量反应杯第一孔。然后玻璃关门关闭，传到第二孔加注激发液位置，依次进行。暗室采用背胶毛毡等材料实现加注针移动过程中的动密封，同时采用交替遮挡方法实现测量室的光密封，能有效去除背景光反射，降低本底噪声，使测量更精准。化学反应所产生的闪光信号通过集光器接收，并在光电倍增管作用下实现信号的放大，通过上位机处理程序分析所得RLU值（relative light unit），获得样本浓度信息，实现待测物的定量或定性分析。

图6 发光检测系统测量室结构图

图7 测量室暗室环境示意图

5 小结

AutolumiS 3000微粒子化学发光体系采用异鲁米诺为化学发光剂，可通过反应中化合物能量的跃迁产生光量子而获得样本的浓度信息，不需要增加外部光源，从而减少了瑞利散射和拉曼散射，背景光信号干扰小，使测量结果更加精准。在免疫反应中采用磁性微粒为载体，与包被管、包被珠相比，反应表面积增大了50倍，可大幅度缩短检测时间，且在磁场作用下可有效实现结合相与游离相的充分无损分离。克服了传统酶免疫方法反应时间长、操作繁琐、灵敏度低等缺点。该体系中还设有微弱闪光信号检测系统，在完全密闭的暗室中完成化学发光反应及闪光信号的收集，消除背景光干扰，从而实现待测物浓度信息准确分析。