循环肿瘤DNA中HER2表达及其与胃癌预后的关系

周颖 陆丽华

上海中医药大学附属第七人民医院 消化科，上海 200137

人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）是表皮生长因子受体家族的成员，定位于染色体17q21，编码相对分子质量为185000的跨膜受体样蛋白，具有酪氨酸激酶活性[1]。HER2在乳腺癌诊疗中的价值已被认可，能独立预测肿瘤复发和生存期长短，并被现行指南作为危险分层和指导治疗的指标之一[2-3]。HER2过表达与胃癌预后的相关性尚不明确[4]，各项研究的结果不一，但Meta分析提示HER2基因扩增及过表达与不良预后有相关性[5-6]。文献报道，在胃癌早期即有肿瘤细胞DNA释放入血，检测循环肿瘤DNA（Circulating tumor DNA,ctDNA）具有无创、实时的优点，并且早于影像学检查结果[7]。本研究采用前瞻性病例对照研究，采用微滴数字PCR（droplet digital PCR System，ddPCR）技术，对胃癌患者血清ctDNA中HER2基因扩增表达进行监测，分析其与肿瘤组织样本免疫组化染色(immuno-histochemistry，IHC)结果的一致性，并分析ctDNA中HER2扩增水平与胃癌患者预后的关系。观察ctDNA中HER2表达的预测价值，为实时、无创检测积累数据，以实现靶向药物治疗患者的精准筛查，从而改善患者预后。

1 资料与方法

1.1 纳入排除标准

入选标准为：1）拟接受根治术的原发性胃癌患者；2）术前无放化疗史；3）临床分期ⅢA期以下，病理组织学证实为腺癌者；4）无严重心肺功能障碍和其他严重合并症。排除合并其它恶性肿瘤史者。

1.2 一般资料

2017年1月至2017年12月于我院确诊拟采用根治术治疗的原发胃癌患者中，抽取术后病理符合入组标准的100例作为胃癌组。抽取同期与胃癌组年龄、性别接近的健康体检者50例为对照组。两组一般资料比较，差异无统计学意义。

1.3 样本采集

胃癌组患者术前采血，血清标本置于-80℃冻存待检。术中切除的肿瘤组织使用福尔马林固定，按照标准程序进行石蜡包埋。对照组入组后采血。

1.4 免疫组化检测

常规石蜡组织切片，厚3μm，衬于涂胶玻片上，放置烤箱中(65℃)烘烤过夜；组织切片经二甲苯脱蜡 3 min×3 次，100%、95%和 75%的酒精脱水各 2 min，自来水冲洗 2 min；3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶，浸泡 10 min，PBS 冲洗 3 min×3 次；EDTA 抗原修复：不锈钢锅内加入配制好的 EDTA 缓冲液，电磁炉上加热至煮沸，将切片置于耐高温塑料切片架中，浸入已沸腾的缓冲液中，盖好加压阀，保温 20 min，停止加热，不锈钢锅自然冷却 2-3 min，自来水冲洗冷却至室温，打开锅盖，取出切片，水洗 2 min，PBS 冲洗3 min×3 次；IHC油笔在组织外围划圈，防止滴加的抗体流失；滴加第一抗体（HER2 抗体，抗体浓度 1：150），以 PBS 缓冲液替代第一抗体，作为空白对照，37℃湿盒内孵育 2.5 h（或过中午），PBS 冲洗 3 min×3 次；甩去 PBS 溶液，滴加即用型二抗，室温孵育 30 min，PBS 冲洗 3 min×3 次；滴加新鲜配制的 DAB 显色液，镜下控制显色时间1-3 min，不超过 5 min，水洗 2min；改良无酒精Carazzi 苏木素液复染数秒，流水洗 5 min；显色片过酒精后烤干，用中性树胶封片，显微镜下观察。根据修订的 Hercep Test 评分系统由 2 名专业病理医师进行独立评分，结果为0/阴性、1+/阴性、2+/不确定、3+/阳性。

1.5 血清ctDNA抽提

取血清350μL，加入等体积1%SDS溶液，20μL蛋白酶K（浓度为20mg/mL），混匀后60℃水浴90min。加入等体积酚：氯仿：异戊醇（5：4：1）混合溶液，剧烈震荡，4℃静置30min后，4℃下离心12000rpm 10min，吸取上清至新的离心管中，注意不要吸到中间乳白色液体层。加入等体积异丙醇，剧烈震荡，-20℃静置沉淀2h或过夜，4℃下离心12000rpm 10min，弃上清。之后用1mL 75%乙醇溶液清洗沉淀两次，开盖至剩余液体挥发干净，加入ddH2O 20μl溶解沉淀，如不能溶解完全，水浴锅中70℃水浴10min后，室温12000rpm离心2min。

1.6 HER2的DNA标准品制备

在南京金斯瑞公司合成人HER2基因的cDNA全长作为HER2标准品，用ddH2O将其溶解为浓度100ng/μL浓度使用。将其梯度稀释至1ng/μL、10ng/μL、50ng/μL备用，作为验证HER2引物的标准品。

1.7 微滴式数字PCR检测HER2基因扩增

HER2基因用FAM标记的TaqMan探针进行检测，同时用RPPH1基因作为参照，探针用HEX标记，将含有样品DNA的反应液通过QX200微滴发生器形成油包水的微滴，然后转移到96孔PCR板在ABI 2720 PCR基因扩增仪进行两步法的PCR扩增，扩增程序为95℃预变性10min；接着95℃变性30sec，60℃退火1min，40个循环；随后98℃加热10min。最后再将PCR板转移到QX200微滴分析仪对所有孔的样品进行荧光检测。HER2拷贝数为HER2基因的浓度与RPPH1基因的浓度之比。结果判读时，相对表达量大于等于1.4倍结果判读为阳性，小于1.4倍结果判读为阴性。所用引物见表1。

表1 ddPCR备选引物

1.8 观察方法

比较胃癌组与对照组HER2阳性率，比较胃癌组免疫组化和数字微滴PCR结果，术后随访18～24个月，比较死亡和复发、转移预后不良患者与未复发患者的HER2基因扩增结果。

所有数据采用SPSS 17.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。计数资料采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组与对照组ctDNA的HER2阳性率比较

胃癌组血清ctDNA的HER2基因扩增结果41例阳性，阳性率41%，对照组阳性率2%，两组间比较差异有显著统计学意义（P＜0.01）。

2.2 胃癌组IHC检测HER2表达与ddPCR扩增结果比较

胃癌组HER2IHC检测2+阳性9例，3+阳性34例，阳性率43%，ddPCR的基因扩增与ICH的符合率为96%(96/100)，见表2。

表2 胃癌组HER2的IHC与ddPCR结果比较（n）

2.3 ctDNA的HER2与胃癌患者预后

100例患者中死亡11例，复发27例，预后不良率38%。ctDNA中HER2阳性患者预后不良率65.85%（27/41）,HER2阴性患者预后不良率18.64%(11/59)。HER2阳性组预后不良率显著高于阴性组，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。如图1所示，预后不良组ctDNA中的HER2的表达量是预后良好组的8.7倍，组间差异有统计学意义。

图1 预后良好与预后不良组HER2表达量

3 讨论

中国属于胃癌高发国家，每年胃癌新发病例约40万例，死亡约35万例，新发和死亡均占全世界胃癌病例的40%[8]，降低胃癌的发病率和死亡率是亟待解决的重大公共卫生问题。随着对肿瘤发生机制的不断研究，对肿瘤信号转导通路研究的不断深入，肿瘤的治疗也进入了一个崭新的靶向治疗时代。而发现新的胃癌预后靶标、精准筛选适合靶向治疗的患者、监测治疗效果、评价预后成为目前的研究热点[9]。针对HER2阳性的靶向药物（曲妥珠单抗、拉帕替尼、帕妥珠单抗）的出现，使得精准筛选HER2阳性的胃癌患者显得更为至关重要。

HER2在正常情况下处于非激活状态，当受到体内外某些因素作用后被激活，具有肿瘤转化活性，最终导致肿瘤的复发和转移[10-11]。HER2基因扩增及过表达与胃癌患者不良预后呈相关性，与胃癌的浸润深度、淋巴结转移及病理分期有关[12-13]。目前，HER2的检测方法主要为对肿瘤组织样本进行基因扩增检测的荧光原位杂交(flurescence in situ hybridization，FISH)和检测蛋白过表达的免疫组化染色(immuno-histochemistry，IHC)两种。胃癌中HER2阳性率报道从6%～35%不等[14-16]，造成这种结果的原因可能有种族不同，样本量过小，非标准化实验的使用等因素。还可能因为FISH和IHC法检测HER2为定性检查，检测者主观判定不一，而且从获取肿瘤组织到判读的整个流程繁琐，影响HER2检测结果的因素非常多，稍有疏漏都有可能影响最终的结果。

更为重要的是，IHC 和FISH法取材困难，研究发现，检测血清ctDNA可以实时动态监测肿瘤基因组信息,被称为“液体活检”。ctDNA是双链DNA片段,主要来源于凋亡或坏死的肿瘤细胞，增殖活跃的肿瘤细胞能主动释放DNA片段到外周循环中[17]。研究证实肿瘤患者ctDNA所携带的肿瘤基因组信息与肿瘤组织具有良好的一致性，能克服常规肿瘤组织活检所无法突破的肿瘤异质性问题[18]。通过对外周循环样本进行ctDNA检测，能协助早期诊断、疗效监测、预后判断，也有助于靶向治疗适应症的评估，从而推进精准医疗的实施。

微滴数字PCR是ctDNA突变定量检测的优选检测手段，可通过单分子扩增实现核酸拷贝数绝对定量，是一种高灵敏度的PCR定量检测技术[19]，目前已被广泛应用到医学、生物学等方面，如拷贝数变异、突变检测、单细胞基因表达分析等，并且在癌症分子标志物的发现、传染病研究、基因组结构变异分析、基因表达分析等领域展现了强大的优势。本研究采用ddPCR技术，检测胃癌患者血清ctDNA中HER2基因扩增表达水平。发现本组患者ddPCR的基因扩增与ICH的符合率为96%(96/100)，证实外周血ctDNA基因信息与肿瘤组织一致。同时，HER2阳性组预后不良率显著高于HER2阴性组，差异有显著统计学意义（P＜0.01），说明ctDNA中HER2与胃癌患者预后密切相关。

总体而言，微滴数字PCR检测ctDNA中HER2表达，能够提供实时的肿瘤负荷进展监测，对肿瘤诊断、疗效评估、预后预测和靶向药物筛查均具有一定价值。