长链非编码RNA 00152对胰腺癌细胞增殖的影响*

何美玲，杨喆，戴研平，雷珊，高晓勤

(1.贵州医科大学 基础医学院，贵州 贵阳 550004；2.遵义医药高等专科学校，贵州 遵义 563006)

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是人类消化道的恶性肿瘤之一，其病情进展迅速易发生早期转移和产生化学抗性，通常患者确诊时已为晚期[1-2]。对PC治疗有手术切除、化学疗法和放射疗法等多种手段，但患者5年生存率仍低于5%[2-3]。因此，详细了解PC发病的分子机制，对寻找新的PC生物标志物和治疗策略的发展具有重要的意义。长链非编码RNA(long noncoding RNA, LncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的不编码蛋白质的 RNA，在多种细胞病理生理过程中起着至关重要的作用，如增殖、凋亡、去分化、周期阻滞、侵袭和迁移等[4-5]。LncRNA异常表达的现象在各种肿瘤中均有发现，提示lncRNA可能是潜在的致癌或抑癌的RNA[6-9]。Linc00152是一种定位于2号染色体(2p11.2)的LncRNA[10]，研究表明其在多种类型的癌症中参与肿瘤发生和转移[11-14]，本课题组前期研究发现Linc00152在胰腺癌组织和细胞系中均高表达，影响胰腺癌患者的生存预后，但Linc00152在胰腺癌中的相关功能及影响尚不清楚。本研究通过干扰胰腺癌细胞株MIA PaCa-2和SW1990中Linc00152的表达，研究Linc00152对胰腺癌细胞增殖能力的影响，为寻找胰腺癌潜在的治疗靶点提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

胰腺癌细胞株MIA PaCa-2和SW1990购自美国ATCC细胞库，胎牛血清(FBS)、转染用OPTI-MEM培养基购自美国Gibco公司，RT试剂盒、PCR相关SYBRP、逆转录试剂盒购自鼎国生物有限公司，CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所，细胞周期试剂盒购自美国Thermo公司，兔抗人单克隆抗体细胞周期蛋白D1(cyclinD1)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)以及鼠抗人GAPDH单克隆抗体均购自武汉赛威尔生物技术有限公司，Lipofectamine 2000和相关转染试剂盒购自Invitrogen公司，Linc00152的下调siRNA序列TAGGCGATACGATGCTTTA-3′、阴性对照(NC)序列TAATCGCTACGATGCACTA-3′及RT-qPCR相关的Linc00152和GAPDH上游、下游引物均由上海生工生物技术有限公司设计合成，Linc00152上游引物5′-AAAATCACGACTCAGCCCCC-3′、下游引物5′-AATGGGAAACCGACCAGACC-3′，GAPDH上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′、下游引物 5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.2 方法

1.2.1细胞培养及转染 人胰腺癌细胞MIA PaCa-2和SW1990分别培养在含10% FBS的DMEM培养基中，均放置于在5% CO2、37 ℃的培养箱中培养；根据Lipofectamine 2000操作说明转染NC及Si-Linc00152序列，实验分为阴性对照组(NC组)和Linc00152干扰组(Si-Linc00152组)，细胞转染48 h后, 进行后续实验。

1.2.2实时荧时聚合酶链式反应(RT-qPCR)验证Linc00152的干扰效率 收集各组转染48 h后的细胞，在TRIzol 试剂，离心、萃取，加异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤，DEPC水溶解，测RNA纯度和浓度。取总RNA 1 000 ng配制RT反应液，Takara逆转录试剂盒进行逆转录反应。按说明书配好PCR反应液后，瞬时离心，上实时荧光定量PCR仪扩增Linc00152以及内参基因GAPDH，通过2-(ΔΔCT)法计算Linc00152的相对表达量。

1.2.3CCK-8实验检测细胞增殖 转染48 h后，胰酶消化各组细胞株，终止消化并重悬细胞，以每孔1×103个细胞，接种到96孔培养板中；于6、24、48、72和96 h时，将 CCK-8的溶液加入每个孔中，在37 ℃下孵育2 h；取出96孔培养板上酶标仪，在450 nm处检测CCK-8的吸光度，根据吸光度描绘曲线。

1.2.4平板克隆细胞集落形成实验 转染48 h后，胰酶消化各组对数生长期的细胞株，用含10%胎牛血清的完全培养基重悬，分别接种到6 cm培养皿中，调整密度为每皿1 200个。然后在5% CO2培养箱中于37 ℃温育8 d，弃去培养基，PBS洗涤2次后，用4%多聚甲醛固定30 min后，倒掉甲醛，加入结晶紫染液染色30 min，倒掉结晶紫液，纯水清洗、拍照，并计数染色的集落形成数目。

1.2.5流式细胞仪检测细胞周期 分别将转染48 h后的各组细胞株接种于6孔板培养72 h，胰酶消化，调整细胞密度1×107个/L，70%乙醇-20 ℃固定过夜后，离心弃上清，加PBS洗净重悬，加入RNA酶、碘化丙啶在37 ℃下避光放置30 min，最后上流式细胞仪检测细胞周期。用CellQuest 软件、ModFit 软件分析实验结果，统计学方法分析各组细胞周期的分布。

1.2.6Western blot检测细胞周期相关蛋白cyclinD1及CDK4表达 取出转染48 h后的各组PC细胞株，加RIPA蛋白裂解液，低温离心，提取总蛋白，加入BCA显色剂，制作标准曲线。蛋白变性10 min，按配方配制SDS-PAGE胶，电泳，转PVDF膜，室温封闭2 h，加一抗4 ℃孵育过夜；次日加二抗于摇床上室温孵育2 h。上曝光机，加ECL化学发光混合液，曝光显影，Image J软件用于分析蛋白质条带的灰度值，统计图分析蛋白表达量。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 转染效率及干扰效率

利用siRNA构建干扰模型 48 h，与NC组比较, Si-Linc00152组的Linc00152表达水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。

注：(1)与NC组比较，P<0.01。图1 转染后胰腺癌细胞Linc00152相对表达量Fig.1 The relative expression of Linc00152 after transfection

2.2 干扰Linc00152后胰腺癌细胞增殖能力受到抑制

通过转染Si-Linc00152干扰Linc00152的表达，结果显示，在72和96 h两个时间节点，Si-Linc00152组较NC组的增殖能力显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见图2。

注：A为MIA PaCa-2，B为SW1990；(1)与NC组比较，P<0.01。图2 干扰Linc00152表达对胰腺癌细胞增殖能力的影响 (CCK8法)Fig.2 Effect of knockdown Linc00152 on the cell proliferation of pancreatic cancer cells by CCK8 assay

2.3 干扰Linc00152后胰腺癌细胞克隆形成能力受到抑制

收集经转染48 h后的各组胰腺癌细胞，细胞在培养皿中培养8 d后，NC组MIA PaCa-2集落形成的数量为(548.3±11.6)个、Si-Linc00152组为(245.0±9.8)个，NC组SW1990集落形成的数量为(562.3±14.1)个、Si-Linc00152组为(306.0±8.4)个，Si-Linc00152组均较NC组的细胞集落形成数目明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)，见图3。

2.4 干扰Linc00152可以阻滞胰腺癌细胞周期于G0/G1期

与NC组比较，Si-Linc00152组在细胞周期中的G1期细胞所占百分比上升，差异有统计学意义(P<0.01)，见图4。提示干扰Linc00152可诱导胰腺癌细胞在G0/G1期细胞周期阻滞。

注：A为平板克隆实验，B为细胞集落形成数；(1)与NC组比较，P<0.01。图3 干扰Linc00152表达对胰腺癌细胞增殖的影响(克隆形成实验)Fig.3 Effect of knockdown Linc00152 on the cell proliferation of pancreatic cancer cells by colony formation assay

注：A～D为流式细胞图，E、F为直条图，A、B、E为MIA PaCa-2，C、D、F为SW1990，A、C为NC组，B、D为Si-Linc00152组；(1)与NC组比较，P<0.01。图4 干扰Linc00152表达后对细胞周期的影响 (流式细胞术) Fig.4 Effect of knockdown Linc00152 on cell cycle of pancreatic cancer cells by FCM

2.5 干扰Linc00152表达后cyclinD1和CDK4蛋白表达

Western blot检测转染48 h时MIA PaCa-2和SW1990细胞蛋白表达水平变化,实验显示，与NC组比较，Si-Linc00152组的细胞周期相关蛋白cyclinD1及CDK4的表达均减少，差异有统计学意义(P<0.01)，见图5。提示干扰Linc00152抑制了胰腺癌细胞株的增殖能力，诱导细胞在细胞周期G0/G1期停滞，可能与细胞周期相关蛋白cyclinD1及CDK4的表达减少有关。

注：A为Western blot结果，B、C分别为MIA PaCa-2、SW1990条图；(1)与NC组比较，P<0.01。图5 干扰Linc00152表达后对胰腺癌细胞中CyclinD1及CDK4蛋白表达的影响Fig.5 The expression of CyclinD1and CDK4 proteins after knocking down Linc00152

3 讨论

LncRNA已成为基因表达的关键调节因子，并在各种癌症的发生和进展中发挥关键作用[15]。Linc00152(长基因间非编码RNA 152)，是一类与癌症相关的828 bp的lncRNA，定位于2号染色体短臂(2p11.2)[16]。有研究表明，Linc00152的高表达与肿瘤进展、淋巴结侵袭和TNM分期进展呈正相关[17]，并且在体外和体内促进肿瘤进展[18]。尽管Linc00152逐步被证实为多种人类恶性肿瘤形成的重要的基因表达调控器，但是其与胰腺癌的关系却尚不清楚。在本实验室前期研究中，发现在Linc00152胰腺癌细胞株和组织中均高表达，且与生存预后密切相关。本研究中，CCK8实验结果显示干扰Linc00152表达后胰腺癌细胞的增殖能力明显降低；平板克隆实验结果表明，沉默Linc00152后胰腺癌细胞克隆数目显著降低；结果表明干扰Linc00152的表达可抑制MIA PaCa-2和S1990细胞的增殖能力。细胞周期主要由细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)驱动，CDK通过在不同细胞周期阶段与细胞周期蛋白(cyclin)结合形成特异性复合物而被激活，并促进细胞通过G1/S期调控点进入S期进行DNA复制，因此促进细胞增殖，异常调节的CDK会诱导细胞不定期增殖[19]。流式细胞术实验表明，沉默Linc00152的表达后G1期MIA PaCa-2和S1990细胞增多，发生细胞周期阻滞；沉默Linc00152后cyclinD1和CDK4的表达下调，而cyclinD1和CDK4是细胞周期G1 向S期转换的调节剂，因此干扰Linc00152能延长G1期的持续时间，阻碍G0/G1到S期的转变，导致细胞在细胞周期G0/G1期停滞，抑制了细胞的增殖。

综上所述，本研究证实干扰Linc00152在体外能抑制胰腺癌细胞株的增殖，显示了Linc00152在胰腺癌发生发展过程中的调控作用，为胰腺癌的分子靶向治疗提供了思路和依据。目前对Linc00152的机制研究仍然不完整，其具体的作用途径及分子生物学机制尚未明确，还需要进一步的探索及研究。