河蟹肝胰腺中4种脂类对细胞生长和亚细胞结构的影响

李文玲， 雷燕芬， 王成辉， 严继舟

(1. 上海海洋大学 海洋生态系统和神经科学研究所∥农业部淡水水产种质资源重点实验室, 上海 201306; 2. 上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心, 上海 201306)

中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)又名河蟹，是我国主要的养殖经济蟹类.河蟹因其独特的口味且具有较高的营养价值而深受消费者的喜欢.河蟹富含丰富的脂类物质，其肝胰腺是脂类的代谢中心，脂类物质的质量分数高达32.79%[1].成永旭等[2]的研究表明：肝胰腺中储存的脂类主要是中性脂，磷脂质量分数很少，仅占总脂的10%～20%，并且这些磷脂含有不同于植物磷脂的多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)成分.脂类是构成生物有机体的主要成分之一，对机体具有重要的生物学作用和生理学调控功能[3-4].活性脂类在细胞内的含量较少却具有重要而独特的生物学功能，是近年来研究的重点和热点.过去的二十年里，越来越多的人意识到某些疾病与脂类的缺乏有关[5].河蟹肝胰腺中脂肪酸的组成主要有: 棕榈酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸.其中多不饱和脂肪酸因其独特的生物活性,已经进入生物制药和营养保健领域.近来的研究表明，多不饱和脂肪酸还参与控制细胞的增殖和分化,是各种脂肪代谢酶和相关蛋白进行基因表达的一种重要调节因子.

目前，关于河蟹肝胰腺脂类功能的研究仅限于脂肪酸类，对于肝胰腺中其他脂类物质在细胞水平的研究鲜有报道.本研究前期的实验通过质谱检测了河蟹肝胰腺中的脂类物质，发现其中含有C-8神经酰胺-1-磷酸，N-十二烷醇-L-高丝氨酸内酯，磷酰胆碱和棕榈酰肉碱4种活性脂类.C-8神经酰胺-1-磷酸是一种新型的具有生物活性的鞘脂类.磷酰胆碱由一个带负电的磷酸基团和一个带正电的胆碱小基团组成，是血小板活化因子的一部分，是一种没有甘油骨架的磷脂[6].C-8神经酰胺-1-磷酸和磷酰胆碱都属于磷脂，主要参与细胞膜的组成.棕榈酰肉碱是一种参与脂肪酸代谢的长链酰基肉碱, 可刺激caspase 3、7和8的活性,在细胞凋亡过程中棕榈酰肉碱的水平会升高[7].N-十二烷醇-L-高丝氨酸内酯属于内脂类化合物，该类化合物大都具有潜在的生物活性.本研究初步探究河蟹肝胰腺中4种脂类物质对斑马鱼胚胎成纤维细胞(PAC2)细胞增殖、细胞毒性和亚细胞结构的影响，以期为活性脂类功能的营养基因组学深入研究提供基础和方法借鉴.

1 材料与方法

1.1 实验材料

PAC2细胞引进于美国国立卫生研究院，C-8神经酰胺-1-磷酸、N-十二烷醇-L-高丝氨酸内酯、磷酰胆碱购于美国Cayman chemical公司，棕榈酰肉碱购于美国Sigma公司，CCK-8试剂盒和LDH试剂盒购于碧云天生物技术有限公司，二甲基亚砜(DMSO)、线粒体标记试剂盒和溶酶体标记试剂盒购于上海生工生物有限公司，细胞培养箱和超净工作台购于美国Thermo Scientific公司，荧光倒置显微镜购于日本Olympus公司，离心机购于美国Eppendorf公司，酶标仪购于美国BioTek公司.

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

PAC2细胞常规培养在含有质量分数为10%胎牛血清的L15培养液中，置于32 ℃的培养箱中培养[8].每48 h传代一次，取对数生长期的细胞用于实验.

A：C-8神经酰胺-1-磷酸; B:N-十二烷醇-L-高丝氨酸内酯; C:磷酰胆碱； D:棕榈酰肉碱

A： C-8 Ceramide-1-phosphate; B: N-dodecanoyl-L-Homoserine lactone; C: Oleyloxyethyl Phosphorylcholine; D: Palmitoyl-L-carnitine inhibited

图1 脂类的化学结构

Fig.1 Chemical structures of lipids

1.2.2 细胞计数试剂盒(CCK-8)检测

取对数生长期的PAC2细胞消化，调整细胞悬液浓度为5×104/mL，接种于96孔培养板中，每孔加入100 μL.贴壁后换无血清培养基继续培养12 h使细胞同步化.吸去孔中的上清液，用PBS缓冲液清洗1～2次.分别加入质量浓度分别为1.25、5、20、80 μg/μL的4种脂类100 μL，同时设立阴性对照组(相同质量浓度脂类溶解介质的DMSO)和空白对照组(无细胞的培养基).将96孔培养板继续置于培养箱中培养24 h和36 h，弃上清并用PBS缓冲液清洗2次.每孔加入10 μL CCK-8和90 μL无血清的L15培养基，32 ℃孵育过夜，用酶标仪(microplate reader)在450 nm处测定各孔的光密度，每个组均有3个复孔[9].

1.2.3 乳酸脱氢酶(LDH)检测

LDH释放检测同CCK-8检测一样, 先用不同质量浓度的4种脂类处理PAC2细胞24和36 h，同时设立空白对照组、阴性对照组和样品最大酶活性对照组(未经脂类处理的用于后续裂解的细胞).到达预定检测时间，将96孔培养板400 g离心5 min，分别取上清液120 μL，加入到新的96孔板对应孔中进行胞外LDH释放检测(细胞沉淀用于后续分析).加入60 μL LDH检测工作液，混匀.室温避光孵育2 h，用酶标仪在490 nm测吸光度值，所有组别均有3个复孔.

上述细胞沉淀用于胞内总LDH含量的检测.加入150 μL用PBS稀释了10倍的LDH释放试剂工作液，摇晃混匀，32 ℃孵育1 h.到达预定时间，将96孔培养板400 g离心5 min.取120 μL上清液加入到新的96孔培养板对应孔中，加入60 μL LDH检测工作液混匀并避光孵育2 h，在490 nm测吸光度值.

1.2.4 线粒体和溶酶体完整性检测

取5×104/mL对数生长期的PAC2细胞100 μL接种到96孔板中，用4种脂类药物干预PAC2细胞24 h，同时设置阴性对照组.加入等体积的溶酶体(红色)和线粒体(绿色)工作液，32 ℃孵育1 h.然后弃上清，用VL15培养基∶VPBS=1∶1的缓冲液洗涤3次.分别用TRITC和FITC滤光器的荧光显微镜(OLYMPUS TH4-200)观察细胞并拍照.

1.3 统计学方法

2 结果与分析

2.1 4种脂类对PAC2细胞增殖及细胞活力的影响

检测药物对细胞的毒性，通常采用的方法是药物加入后测定细胞的存活与增殖情况[12].本实验通过CCK-8分别检测了不同质量浓度的4种脂类对PAC2细胞增殖和细胞活性的影响，结果分析用相对细胞数量(实验组光密度与对照组光密度的比值)表示.24 h的结果显示(图2A)，在质量浓度1.25 μg/mL时，4种脂类物质对PAC2细胞计数均未表现出明显的改变.在质量浓度5、20和80 μg/mL的磷酰胆碱显著抑制PAC2细胞增殖，表现为相对细胞数量比对照组明显降低；C-8神经酰胺-1-磷酸和棕榈酰肉碱在质量浓度20和80 μg/mL时也表现为相对细胞数量的显著降低，且呈现剂量依赖性.而N-十二烷醇-L-高丝氨酸内酯在质量浓度5和80 μg/mL时对PAC2细胞表现为极显著的促进细胞增殖的活性.

培养36 h的观察显示(图2B)，在1.25、5、20和80 μg/mL质量浓度下C-8神经酰胺-1-磷酸、磷酰胆碱和棕榈酰肉碱对PAC2细胞均表现为抑制细胞增殖，与24 h的实验结果基本吻合.但N-十二烷醇-L-高丝氨酸内酯表现为抑制细胞增殖的活性，与24 h的实验结果相反.

A: 24 h CCK-8分析; B: 36 h CCK-8分析. 与对照组比较，1)P<0.01；2)P<0.05.A: 24 h CCK-8 assay; B: 36 h CCK-8 assay. Compared with control group, 1)P<0.01; 2)P<0.05.

2.2 4种脂类物质对细胞代谢和细胞生长的影响

细胞膜结构的损坏会导致胞浆内的酶释放到培养液中，其中包括酶活性较稳定的乳酸脱氢酶.乳酸脱氢酶释放检测被认为是细胞膜完整性检测的重要指标，根据胞浆中乳酸脱氢酶能通过受损细胞膜漏出的特点[12]，通过检测细胞培养液中乳酸脱氢酶的活性，可实现对细胞膜完整性的定量分析.结果分析用相对LDH含量(实验组光密度与对照组光密度的比值)表示.

使用不同质量浓度的C-8神经酰胺-1-磷酸处理PAC2细胞.细胞处理24 h的结果显示(图3A)：与对照组相比，培养液中LDH的相对含量在1.25和5 μg/mL质量浓度下均显著降低，在20和80 μg/mL质量浓度下均显著升高.36 h的结果显示(图3B)：培养液中LDH的相对含量在5、20和80 μg/mL质量浓度下均显著升高，并存在剂量依赖.

使用不同质量浓度的N-十二烷醇-L-高丝氨酸内酯处理PAC2细胞.细胞处理24 h的结果显示：培养液中LDH的含量在1.25、5、20、80 μg/mL质量浓度下均显著高于对照组；但36 h的结果显示：培养液中LDH的相对含量在5和20 μg/mL质量浓度下没有明显变化，在1.25和80 μg/mL质量浓度下与24 h的实验结果一致.

使用不同质量浓度的磷酰胆碱处理PAC2细胞.细胞处理24 h和36 h的结果基本一致：培养液中LDH的相对含量在1.25 μg/mL质量浓度下没有显著变化，而5、20、80 μg/mL质量浓度下均显著升高，且存在剂量依赖.

使用不同质量浓度的棕榈酰肉碱处理PAC2细胞.细胞处理24 h和36 h的结果基本一致：培养液中LDH的相对含量在1.25、5和80 μg/mL质量浓度下均显著升高.但20 μg/mL质量浓度下培养液中LDH的相对含量仅在36 h表现为显著升高，24 h未发生显著变化.

A: 24 h LDH释放分析; B: 36 h LDH释放分析. 与对照组比较，1)P<0.01；2)P<0.05.A: 24 h the release of LDH assay; B: 36 h the release of LDH assay. Compared with control group, 1)P<0.01; 2)P<0.05.

细胞内总LDH的含量一方面可以反映细胞糖酵解代谢生成乳酸的能力，另一方面得以间接反应细胞数量的多少.结果分析用相对LDH含量表示.C-8神经酰胺-1-磷酸和磷酰胆碱处理的PAC2细胞24 h(图4A)和36 h(图4B)的实验结果基本一致：在1.25 μg/mL质量浓度下细胞内总LDH含量没有显著变化；在5 μg/mL质量浓度下细胞内总LDH相对含量显著升高；在20和80 μg/mL质量浓度下细胞内总LDH相对含量显著降低.N-十二烷醇-L-高丝氨酸内酯处理PAC2细胞24 h和36 h的实验结果基本一致：在1.25 μg/mL质量浓度下细胞内总LDH含量显著下降；在5 μg/mL质量浓度下细胞内总LDH含量没有显著变化；在80 μg/mL质量浓度下细胞内总LDH含量显著升高.棕榈酰肉碱处理PAC2细胞24 h和36 h的实验结果显示：在1.25、20、80 μg/mL质量浓度下细胞内总LDH相对含量均极显著降低，但5 μg/mL的质量浓度下仅24 h时细胞内总LDH含量有显著降低.

A: 24 h LDH 分析; B: 36 h LDH 分析. 与对照组比较，1)P<0.01；2)P<0.05.A: 24 h LDH assay; B: 36 h LDH assay. Compared with control group, 1)P<0.01; 2)P<0.05.

2.3 线粒体和溶酶体的形态结构观察

线粒体和溶酶体对细胞能量和脂类代谢以及维持细胞内稳态发挥重要作用，在很多疾病中都观察到他们的功能缺陷.线粒体和溶酶体通过RAB7 GTP酶的作用相互交流，对实现细胞的完整功能具有重要作用[13].为了进一步验证4种脂类物质是否会影响PAC2细胞中溶酶体和线粒体的形态，本研究分别用溶酶体和线粒体专属染料对质量浓度为80 μg/mL的4种脂类处理后的PAC2细胞进行染色.结果显示：阴性对照组的溶酶体和线粒体均呈现单层完整的形态结构；N-十二烷醇-L-高丝氨酸内酯组的溶酶体和线粒体与对照组相似，呈现单层完整的形态结构；C-8神经酰胺-1-磷酸组溶酶体发生粘连，线粒体拖着一个纤长的尾巴；磷酰胆碱组的溶酶体出现粘连和聚集，线粒体发生聚集且由椭圆形转变为梭形；棕榈酰肉碱组溶酶体出现粘连，线粒体的体积变大(图5).

嵌入图是细胞的放大图. 标尺:50 μmInsets show magnification of individual cells. Scalebar: 50 μm.

3 讨论

脂类物质不仅为机体提供能量，而且参与细胞发育及凋亡等多种生物过程的调节.河蟹可食用部分的脂类物质含量丰富，对人类健康有益的生物活性物质和功能性成分也越来越受到研究者的关注.

神经酰胺-1-磷酸(ceramide-1-phosphate, C1P)是神经酰胺经过神经酰胺激酶(ceramide kinase, CERK)磷酸化合成的具有生物活性的鞘脂类.C1P是细胞生长、生存、迁移和炎症的关键调节因子[14-15]. 一些资料表明C1P通过刺激DNA的合成和细胞分裂促进有丝分裂，同时抑制丝氨酸棕榈酰转移酶(serine palmitoyltransferase, SPT)活性和神经酰胺积累而抑制细胞凋亡[16-18].本实验用胚胎成纤维细胞试验，结果表明C-8神经酰胺-1-磷酸抑制细胞增殖，改变细胞膜结构的完整性.特别在20 μg/mL及以上质量浓度时，胞外LDH含量增高，胞内LDH含量降低，同时使亚细胞水平的线粒体和溶酶体形态结构发生了改变.这些结果说明C-8神经酰胺-1-磷酸的作用可能具有组织细胞特异性.

N-十二烷醇-L-高丝氨酸内酯可以特异性诱导粒细胞和单核细胞的凋亡，并且在较低质量浓度下有明显的剂量依赖性.除了细胞毒性的作用外，还可以改变人体的细胞循环和新陈代谢[19].有报道称来自绿脓杆菌的3-oxo-N-十二烷醇-L-高丝氨酸内酯具有促凋亡的活性[20].在本实验中，N-十二烷醇-L-高丝氨酸内酯处理的PAC2细胞，其胞外LDH的释放以及胞内总LDH含量都增加，说明N-十二烷醇-L-高丝氨酸内酯促进细胞糖酵解代谢的同时改变了细胞膜结构的通透性.结合胞内和胞外LDH含量的变化，以及CCK-8在24和36 h出现相反的实验结果，说明N-十二烷醇-L-高丝氨酸内酯增强糖酵解代谢和乳酸生成，并且逐渐抑制线粒体的有氧氧化.

磷酰胆碱是磷脂酶A2的抑制剂[21]，但磷酰胆碱的细胞毒性活性尚不清楚，其对亚细胞结构变化的研究鲜有报道.在本研究中，磷酰胆碱表现为抑制细胞增殖和增加胞外LDH释放，说明磷酰胆碱对细胞膜有一定程度的损坏，同时能改变线粒体和溶酶体的形态结构.

棕榈酰肉碱可以促进脂肪酸在氧化过程中从细胞质转移到线粒体中.Tominaga等[22]的研究表明过量的外源性棕榈酰肉碱-长链饱和脂肪酸中间体可能在棕榈酰肉碱和棕榈酰辅酶A之间以不同方式扰乱线粒体的功能.Vescovi等[23]的研究表明棕榈酰肉碱以剂量依赖性的方式抑制黑色素瘤细胞的生长.本实验结果表明棕榈酰肉碱抑制细胞增殖并且存在剂量依赖性，并使线粒体和溶酶体的形态结构发生了改变，这与先前的研究结论一致.同时本实验也表明，棕榈酰肉碱对细胞膜的损伤有严格的质量浓度限制.

本实验从细胞水平和亚细胞水平相互验证4种脂类对PAC2细胞的影响.CCK-8检测利用细胞线粒体内的脱氢酶能将检测试剂内的唑盐还原成橙黄色的甲瓒，甲瓒的生成量与脱氢酶的活性呈正相关.因此，对甲瓒溶液进行比色测定即可检测细胞毒性和细胞增殖[24].LDH 存在于细胞浆中[25]，膜结构改变常会出现细胞膜完整性受损和渗漏现象，通过检测胞外LDH释放的活性可以评估细胞膜的受损程度.同时LDH与恶性肿瘤密切相关，Warburg效应是肿瘤细胞能量代谢的重要特征之一，Warburg效应不仅增强了糖酵解作用，同时通过将丙酮酸转化为乳酸来抑制线粒体的氧化磷酸化.缺氧情况下，恶性肿瘤细胞中的LDH催化丙酮酸生成乳酸，使糖酵解速率提升，形成的酸性微环境对LDH形成负反馈调节[26-28].本实验利用CCK-8检测和胞内胞外LDH检测，一方面可以反映细胞数量的变化，另一方面可以评估葡萄糖分解途径：糖酵解和三羧酸循环有氧氧化比例.另外，通过线粒体和溶酶体结构检测进一步验证细胞膜稳定性和线粒体内三羧酸循环能量代谢的变化.

综上所述，河蟹肝胰腺中的4种脂类物质对PAC2细胞所表现出的细胞增殖和细胞毒性与细胞线粒体和溶酶体形态结构的完整性之间存在一定的联系，揭示它们具有明显的生物活性，能影响细胞代谢和生长.显示天然活性物质应用于临床治疗的可能性，促进了河蟹脂类活性物质研究的发展.进一步研究这些脂类对细胞凋亡和细胞周期的影响将有助于揭示它们的生物活性作用机制.

致谢:感谢上海海洋大学水产与生命学院和神经科学研究所的老师和同学，以及吴昊、刘益宁老师和朱双光同学对本实验课题研究上的技术帮助.