CXCL1在子宫内膜样腺癌中的表达及其对Ishikawa细胞增殖侵袭的影响

孟洁, 李红雨, 赵书君, 石鸿玉, 付晗

(郑州大学 第三附属医院 妇科肿瘤病区， 河南 郑州 450000)

子宫内膜癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，在我国的发病率呈逐年上升趋势[1].子宫内膜样腺癌是子宫内膜癌中发病率最高的一种类型,预后较好，但仍有部分晚期患者的手术、内分泌、放化疗等治疗效果欠佳，亟待寻找新的治疗靶点[2].趋化因子配体1[chemokine (C-X-C motif) ligand 1，CXCL1]，也称为生长调节因子α，是一种分泌型生长因子，在多种肿瘤中表达上调，有研究发现CXCL1能够促进肿瘤细胞的增殖及侵袭，还能够趋化肿瘤相关免疫细胞参与构建肿瘤微环境，进而促进肿瘤的发展[3].关于CXCL1在子宫内膜样腺癌中的表达及作用机制，目前少有报道.本研究通过检测子宫内膜样腺癌和子宫内膜非典型增生患者的子宫内膜组织及正常增生期子宫内膜组织中CXCL1的表达，并从细胞水平验证其功能，探讨CXCL1与子宫内膜样腺癌增殖侵袭的相关性，期望为肿瘤靶向治疗提供一个可能思路[4].

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本

2016年9月至2018年12月于我院行手术治疗经术后病理证实为子宫内膜样腺癌患者的子宫内膜组织，一部分(50例)福尔马林固定，一部分(30例)-80 ℃保存，同时于手术标本取出10 min内收集距肿瘤边缘2 cm范围外的体积为3 mm×3 mm×3 mm的内膜组织(病理证实为正常子宫内膜组织)作为对照，放置-80 ℃保存，后续用于QRT-PCR检测.同期借阅我院病理科诊断为子宫内膜非典型增生患者的子宫内膜组织及正常增生期子宫内膜组织的石蜡包埋标本，各40例.入选人群已排除应用激素类药物、合并有自身免疫性疾病、其他恶性肿瘤者、或经放化疗者.该实验已通过我院伦理委员会，并与患者签署书面或口头知情同意书.

1.1.2 细胞

人子宫内膜高分化腺癌细胞株Ishikawa细胞购自中科院协和细胞库.

1.1.3 主要试剂及器材

高糖DMEM培养基购自美国Hyclone公司，胎牛血清购自以色列BI公司，CCK-8试剂盒购自日本同仁公司，AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡检测试剂盒购及基质胶均购自美国BD公司，transwell小室购自美国Corning公司，逆转录试剂盒及SYBR荧光定量检测试剂盒购自日本TOYOBO公司，QRT-PCR引物购自北京擎科有限公司，兔抗人多克隆抗体CXCL1、兔抗人单克隆抗体MMP9及Caspase-3、CXCL1 ELISA试剂盒购自武汉三鹰集团，兔抗人单克隆抗体pNF-κB p65及β-actin购自美国Cell Signaling Technology公司，DAB免疫组化试剂盒购自北京康为世纪有限公司，CXCL1干扰siRNA购自上海吉玛有限公司，转染试剂lipofectamine3000及BCA蛋白定量试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific集团.倒置荧光显微镜IX71(IX2-1LL100)购自奥林巴斯医疗株式会社，双色红外激光扫描成像系统(Odyssey CIX)购自美国LI-CORinc公司，酶标仪(Thermo-MK3)购自美国ThermoFisher公司.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

Ishikawa细胞用含体积分数为10%胎牛血清的高糖DMEM培养基(以下简称“完全培养基”)，置于37 ℃，体积分数为5% CO2培养箱中，当融合度达70%～90%时，进行胰蛋白酶消化传代或者计数铺板.

1.2.2 免疫组织化学染色法(IHC)检测CXCL1蛋白的表达

组织固定及石蜡包埋切片，依次脱蜡，灭活内源性酶，热修复抗原，血清封闭，一抗(V一抗∶V抗体稀释液=1∶200)孵育，4 ℃过夜，洗涤，二抗孵育30 min后进行DAB染色，复染，封片，显微镜下观察.CXCL1主要定位于胞浆，少数胞膜可见.结果采用半定量积分法判定：随机选取5个400倍高倍视野，在每个高倍视野下计数100个细胞(胞膜染色或胞膜、胞浆同时染色为阳性细胞)，无着色记录为0分，淡黄色记录为1分，棕黄色记录为2分，棕褐色记录为3分，记录5个视野的平均数：0～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分；51%～75%为3分，>75%为4分，染色强度与阳性细胞百分比得分乘积小于4为阴性，≥4为阳性.由两位高年资病理医师通过独立双盲法读片评定免疫组化结果.

1.2.3 QRT-PCR法检测组织及细胞中CXCL1mRNA的表达

提取RNA逆转录合成cDNA，使用SYBR预混式荧光定量试剂盒，总反应体系为20 μL,模板cDNA质量浓度为0.5 ng/μL. CXCL1引物序列为Forward：5′-CCCAAACCGAAGTCATAGCC-3′，Reverse：5′-ATC-CGCCAGCCTCTATCACA-3′；内参GAPDH序列为Forward: 5′-AGAACGGGAAGCTT-GTCATC-3′，Reverse:5′-CATCGCCCCACTTGATT-TTG-3′. 反应条件为：95℃预变性30 s，95℃变性15 s，65℃退火15 s，72 °C延伸45 s，进行40个循环.系统自动检测荧光，得出Ct值(循环阈值).运用2-ΔΔCt法计算CXCL1的表达情况.

1.2.4 siRNA技术干扰细胞CXCL1基因的表达

按照lipofectamine3000说明书操作.用荧光标记的阴性对照siRNA转染细胞株，在荧光显微镜下检测转染效率.转染效率大于70%后，分别转染三条阳性siRNA，即siCXCL1-249,siCXCL1-322和siCXCL1-376.48 h后使用QRT-PCR检测CXCL1的mRNA表达，72 h后ELISA法检测上清液中CXCL1的蛋白表达，选择干扰效率最佳的一条siRNA进行后续细胞实验.

1.2.5 CCK-8实验检测细胞增殖

将细胞按照5×103/孔的密度接种于96孔板中，加入100 μL培养液，24 h后，CXCL1沉默组转染干扰效率最佳的siRNA,NC(normal control)组转染阴性对照RNA，于转染后0、48、72 h加入CCK-8试剂10 μL，37 ℃细胞培养箱放置1.5 h，检测450 nm处的光密度.

1.2.6 流式细胞仪Annexin Ⅴ-FITC/PI法检测细胞凋亡率

将细胞按照1×105/孔接的密度种于6孔板上，完全培养基培养24 h后，CXCL1沉默组转染筛选的干扰效率最佳的siRNA，NC组转染阴性对照siRNA，培养48 h后，用不含EDTA的胰酶消化，收集细胞，以1 000 r/min离心5 min，PBS清洗细胞2 次，收集(1～5)×105个细胞加入binding buffer体积400 μL置冰浴,每管内加入FITC-Ⅴ体积5 μL，于流式细胞仪检测前加入PI体积5 μL，binding buffer体积100 μL混匀，避光孵育15 min，加入PI后1 h内用流式细胞仪检测.

1.2.7 细胞划痕实验检测细胞迁移能力

将细胞按照3×105/孔的密度接种于6孔板中，加入完全培养基2 mL,24 h后，CXCL1沉默组转染干扰效率最佳的siRNA,NC组转染阴性对照RNA，转染6 h后用10 μL枪头参照直尺在6孔板底部划线，间隔1 cm划两条直线，再垂直它们划两条间隔1 cm的直线，PBS冲洗3次，加入无血清培养基，分别于0、48、72 h拍照记录.划痕宽度代表细胞的迁移能力，通过Image J划线法测量，细胞的迁移能力用迁移率表示.迁移率=(0 h间隙宽度-观察时间点间隙宽度)/0 h间隙宽度.

1.2.8 transwell实验检测细胞侵袭能力

用Matrigel胶1∶4稀释后取50 μL置于transwell小室上室，37 ℃放置5 h，吸弃多余液体，加入100 μL无血清培养基水化基质胶，37 ℃，30 min后吸弃培养液.收集转染48 h后的细胞，PBS清洗3次，无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为1×105/mL，吸取200 μL细胞混悬液置于上室，下室内加入600 μL体积分数为20%胎牛血清的培养基，37 ℃培养72 h后，用质量分数为4%的多聚甲醛，固定30 min，清洗后4 ℃风干，用质量分数为0.1%的结晶紫染色后显微镜下观察，取6个视野平均细胞数，代表肿瘤细胞的侵袭能力.

1.2.9 Western Blot检测蛋白表达

将细胞按照1×105/孔接种于6孔板上，完全培养基培养24 h后，CXCL1沉默组转染筛选的干扰效率最佳的siRNA，NC组转染阴性对照siRNA，继续培养72 h后，弃去原培养基，用预冷PBS清洗细胞1次，胰蛋白酶消化贴壁细胞，显微镜下观察细胞基本脱落时加入足量完全培养基终止消化，收集细胞至10 mL离心管，1 500 r/min离心10 min，弃上清，用预冷PBS清洗一次，加RIPA裂解液于冰上裂解30 min，转入1.5 mL离心管，于4 ℃，12 000 r/min离心30 min，收集上清液，用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白质量浓度，按比例(V蛋白溶液体积∶V上样缓冲液体积=1∶4)加入上样缓冲液，于100 ℃沸水中变性10 min，每组上样蛋白质量为40 μg，行质量分数为10%的SDS-PAGE电泳分离目的蛋白，冰浴条件下300 mA恒流1 h转至PVDF膜，用质量分数为5%的脱脂牛奶于室温封闭1.5 h，TBST洗涤4次，每次5 min，稀释后的一抗(V一抗∶V抗体稀释液=1∶1 500)孵育，4 ℃过夜，TBST洗涤4次，每次5 min，稀释后的二抗(V二抗∶V抗体稀释液=1∶1 500)孵育1 h，TBST洗涤4次，每次5 min，Immobilion Western HRP底物发光液暗室显像，Image J软件分析条带灰度值，取目的条带灰度值与内参条带灰度值的比值为目的蛋白的相对表达量.

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 不同子宫内膜组织中CXCL1的表达情况

CXCL1定位于胞浆内，正常增生期子宫内膜组织，非典型增生子宫内膜组织及子宫内膜样腺癌组织的阳性率分别为40.0%， 62.5%，76.0%，子宫内膜样腺癌组织阳性率与非典型增生子宫内膜组织之间比较无统计学差异(P>0.05)，但均显著高于正常增生期组织(P<0.05)，免疫组化图像见图1，CXCL1在各组织中的表达情况见表1.在不同年龄、是否绝经、不同分化程度及不同浸润深度的患者中，CXCL1的表达无显著统计学差异，而在肿瘤直径较大、有淋巴结转移及分期较晚的患者中，CXCL1的表达显著升高，具有统计学差异(P<0.05，表2).

A:正常增生期子宫内膜组织；B:非典型增生子宫内膜组织；C:子宫内膜样腺癌组织.

表1 不同组织类型中CXCL1免疫组化结果的阳性率

Table 1 Positive expression rate of CXCL1 in different kind of tissues measured by immunohistochemistry assay

组别nn阳性(%)n阴性(%)正常增生期子宫内膜组织4016(40.0)24(60.0)非典型增生子宫内膜组织4025(62.5)15(37.5)1)子宫内膜样腺癌组织5038(76.0)1)12(24.0)

1)与正常子宫内膜组织比较，P<0.05.

1)Compared with proliferative endometrial tissues，P<0.05.

表2 CXCL1表达与子宫内膜样腺癌临床病理参数的相关性

Table 2 Correlation between CXCL1 expression and clinicopathological parameters of endometrioid adenocarcinoma

临床病理参数n高表达n低表达2值P值年龄/岁0.1190.730 ≤50185 >50207绝经0.6750.411 是215 否177分化程度1.5220.467 高分化287 中分化43 低分化62浸润深度1.1450.285 <1/22711 ≥1/2111肿瘤直径5.2460.036 <6 cm2111 ≥6 cm171淋巴转移5.6450.018 有151 无13分期6.9480.008 Ⅰ-Ⅱ期2011 Ⅲ-Ⅳ期181

共有20名患者进行淋巴结清扫术(术前大部分患者已行内膜诊刮，对于淋巴结的清扫，结合术中剖开暴露宫腔明确肿瘤直径以及术前MRI决定，所选入组患者均未行术前放化疗).

A total of 20 patients underwent lymph node dissection (most patients had undergone endometrial scraping before surgery, for lymph node dissection, combined with intraoperative exposure of the uterine cavity to determine the tumor diameter and preoperative MRI decision, none of the selected patients were enrolled preoperative radiotherapy and chemotherapy).

2.2 CXCL1在子宫内膜样腺癌组织中的表达

在子宫内膜样腺癌组织与癌旁组织中的CXCL1mRNA表达水平分别为：(3.35±1.85)，(1.76±1.86),CXCL1在癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织，有统计学差异(F=0.034，P=0.002)，见图2.

1)与癌旁组织比较，P<0.01.

1)Compared with adjacent tissues,P<0.01.

图2 子宫内膜样腺癌与癌旁组织中CXCL1的相对表达

Fig.2CXCL1mRNA expression in endometrioid adenocarcinoma tissues and adjacent tissues

2.3 干扰效率最佳siRNA的选择

优化转染条件，使转染效率大于70%，转染后各组细胞的荧光图像见图3.转染后48 h，经QRT-PCR法检测，NC组、siCXCL1-249组、siCXCL1-322组、siCXCL1-376组CXCL1mRNA的相对表达量分别为(1.21±0.65)，(0.09±0.03)，(0.19±0.18)，(0.05±0.04).与NC组比较，其余3组CXCL1mRNA的表达量均显著降低(P<0.05)，但3组之间比较无统计学差异(P>0.05).转染后72 h，NC组、siCXCL1-249组、siCXCL1-322组、siCXCL1-376组细胞上清液中CXCL1的蛋白质量浓度分别为(96.00±15.75)pg/mL，(37.80±12.07)pg/mL，(62.20±9.26)pg/mL，(25.2±5.26)pg/mL.与NC组比较，其余3组CXCL1的蛋白质量浓度均显著降低(P<0.05)；siCXCL1-376组与其他3组之间均有统计学差异(P<0.05)(图4).故选取siCXCL1-376作为干扰siRNA沉默CXCL1基因表达，进行后续细胞实验.

2.4 沉默CXCL1后Ishikawa细胞增殖情况

与NC组比较，转染24 h后，CXCL1沉默组的细胞增殖无统计学变化，转染48、72、96 h后，CXCL1沉默组的细胞增殖明显受到抑制(P<0.05，P<0.01)，且随着时间延长，抑制作用更加明显(图5).

图3 普通光学显微镜及荧光显微镜下siRNA转染情况(×400)

1)与NC组比较，P<0.05；2)与siCXCL1-249组比较，P<0.05；3)与siCXCL1-322组比较，P<0.05.1)Compared with NC group，P<0.05；2)Compared with siCXCL1-249 group，P<0.05；3)Compared with siCXCL1-322 group，P<0.05.

1)与NC组比较，P<0.05；2)与NC组比较，P<0.01.

1)Compared with NC group，P<0.05；2)Compared with NC group，P<0.01.

图5 沉默CXCL1后细胞增殖情况

Fig.5 Proliferation of Ishikawa cells withCXCL1knockdown

2.5 沉默CXCL1后Ishikawa细胞凋亡情况

转染72 h后，NC组与CXCL1沉默组的凋亡率分别为(6.3±0.3)%，(8.7±0.7)%，与NC组比较，CXCL1沉默组的凋亡率显著降低，具有统计学差异(P=0.012<0.05，图6).流式细胞仪检测的凋亡率数值较低，故加测凋亡蛋白Caspase-3蛋白表达以进一步验证. NC组与CXCL1沉默组Caspase-3蛋白的相对表达量分别为(0.34±0.02),(0.64±0.11)，与NC组比较，CXCL1沉默组的Caspase-3蛋白表达显著升高(P<0.05)，见图7.

2.6 沉默CXCL1后Ishikawa细胞迁移能力变化

与NC组比较，转染48 h后，CXCL1沉默组的细胞迁移率无统计学变化，转染72 h后，CXCL1沉默组的细胞迁移率显著降低(P<0.05，图8).

1)与NC组比较，P<0.05.
1)Compared with NC group，P<0.05.

图6 沉默CXCL1后Ishikawa细胞凋亡情况

Fig.6 Apoptosis of Ishikawa cells withCXCL1knockdown

图7 沉默CXCL1后Ishikawa细胞Caspase-3蛋白的表达情况

Fig.7 Expression of Caspase-3 protein in Ishikawa cells withCXCL1knockdown

2.7 沉默CXCL1后Ishikawa细胞侵袭能力变化

NC组与CXCL1沉默组细胞平均穿膜细胞数分别为(95.33±13.01)，(24.33±6.66)，与NC组比较，CXCL1沉默组穿膜细胞数量明显减少，具有统计学差异(P=0.004<0.05，图9).

2.8 沉默CXCL1后 Ishikawa细胞pNF-κB及MMP9蛋白的表达

NC组与CXCL1沉默组NF-κB p65蛋白的相对表达量分别为(0.85±0.15)，(0.81±0.13)，pNF-κB p65蛋白的相对表达量分别为(0.69±0.13)，(0.32±0.08)，NF-κB p65蛋白的磷酸化率分别为(81.25±15.56)%，(40.61±12.52)%，与NC组比较，CXCL1沉默组NF-κB p65蛋白的磷酸化率显著降低(P<0.05)；两组MMP-9的相对蛋白表达量分别为(0.64±0.08)，(0.17±0.07)，与NC组比较，CXCL1沉默组MMP-9蛋白表达显著降低(P<0.05).见图10.

图8 沉默CXCL1后Ishikawa细胞迁移情况(×400)

Fig.8 Migration of Ishikawa cells withCXCL1knockdown(×400)

1)与NC组比较，P<0.05.1)Compared with NC group，P<0.05.

图10 沉默CXCL1后Ishikawa细胞pNF-κB及MMP9蛋白的表达情况

Fig.10 Expression of pNF-κB and MMP9 protein in Ishikawa cells withCXCL1knockdown

3 讨论

子宫内膜样腺癌是子宫内膜癌中发病率最高的一种类型，预后较好，但仍有一部分患者发现时疾病已到晚期，故需要更有效的新的治疗手段.有研究显示趋化因子及相关信号通路的激活与肿瘤的进展转移有关，而子宫内膜样腺癌的预后与某些特定趋化因子关系密切，已有研究显示趋化因子配体12[chemokine (C-X-C motif) ligand 12，CXCL12]，白介素8(interleukin-8，IL-8)， 基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)等趋化因子及相应受体在子宫内膜样腺癌组织中高表达，对其发生发展具有促进作用[5-7]，可能成为治疗子宫内膜样腺癌的新靶点.因此探究趋化因子与子宫内膜样腺癌的关系也可能为肿瘤靶向治疗提供依据.

CXCL1是趋化因子家族中的一员，可通过自分泌与旁分泌模式调节细胞增殖凋亡及转移相关信号通路，亦可以通过募集白细胞和激活促炎介质塑造肿瘤微环境而促进肿瘤生长和转移[8].Kuo[9]的研究小组报道，CXCL1可激活前列腺癌中的NF-κB/HDAC1(nuclear factor kappa-B/histone deacetylase 1)信号通路，进而促进细胞增殖；有学者[10]进行体外实验发现，重组人抗CXCL1抗体可减少白介素6(Interleukin-6，IL-6)及金属蛋白酶MMPs(matrix metalloproteinase)的产生，增加金属蛋白酶组织抑制因子4[tissue inhibitor of metalloproteinases4(TIMP-4)]的产生进而抑制前列腺癌细胞的迁移、侵袭；Korivi过表达CXCL1后发现丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activited protein kinase，MAPK)途径被激活，上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相关产物增加，进而促进乳腺癌细胞的迁移、侵袭[11].大量关于卵巢癌[12]及乳腺癌[13]的研究表明，CXCL1通过与多种肿瘤相关免疫细胞表面均会表达的CXCR2(C-X-C chemokine receptor type 2)受体结合，可增加髓源性巨噬细胞的产生及募集，稳固肿瘤微环境，加强免疫抑制[14]，进而促进肿瘤进展.

然而关于CXCL1与子宫内膜样腺癌相关性的研究较少，本研究发现子宫内膜样腺癌组织中CXCL1表达显著升高，不同病理分级的子宫内膜样腺癌组织中CXCL1表达差异不明显，肿瘤直径较大、有淋巴转移、分期较晚患者的子宫内膜样腺癌组织中CXCL1表达量显著升高，提示其可能成为子宫内膜样腺癌的一种潜在的肿瘤标志物.体外实验中，沉默CXCL1后，细胞增殖明显被抑制，细胞凋亡率及凋亡蛋白Caspase-3表达量均增加，细胞迁移及侵袭能力均降低.

NF-κB是在生物体内普遍存在并稳定表达的一种转录因子，可因各种致癌物质、生长因子等的刺激发生磷酸化、泛素化而被激活，从而发挥生物学作用，在包括子宫内膜样腺癌在内的多种类型肿瘤中调节细胞增殖凋亡、血管形成及转移[15].本研究发现，沉默CXCL1后，磷酸化的NF-κB蛋白表达量减少，而EMT促转移相关物质金属蛋白酶MMP-9蛋白表达量也减少，MMP-9被证明多为NF-κB依赖型，在NF-κB调控下，发挥增加血管形成、促进肿瘤转移等作用[16-17].本研究提示沉默CXCL1可能下调磷酸化NF-κB进而抑制Ishikawa细胞的增殖、迁移能力及侵袭能力，促进细胞凋亡，发挥对肿瘤的抑制作用.而有学者在结肠癌的相关报道中提出CXCL1基因近端启动子有NF-κB反应元件，CXCL1可能依赖NF-κB的活化而被激活表达增加，进而促进肿瘤生长[18]，结合本实验，猜想CXCL1与NF-κB可能存在一种反馈调节，共同促进肿瘤的增殖侵袭，这需要进一步验证.

总而言之，结合免疫组化和组织QRT-PCR结果以及体外实验结果，证明CXCL1在子宫内膜样腺癌组织中表达升高，沉默CXCL1可以降低Ishikawa细胞增殖、迁移及侵袭能力，促进细胞凋亡，CXCL1可能通过NF-κB磷酸化发挥促肿瘤进展的作用.后续可予以不同类型的子宫内膜癌细胞株来明确CXCL1在其他类型子宫内膜癌中的表达，后期本课题组也将以肿瘤相关免疫细胞为出发点寻找其相关性.肿瘤发生纷繁复杂，多种蛋白通路交错构成一个复杂的网络，CXCL1与子宫内膜样腺癌发生发展可能有更多的机制需要去探索.结合CXCL1对肿瘤自身增殖侵袭作用的抑制，也为肿瘤的靶向治疗提供了一个可能，然而其能否用于临床，仍需后续大量实验以及临床大数据研究.