猪肌内脂肪前体细胞分离培养和成脂诱导分化研究

孟金花，蔡刚志，肖红卫，华再东，毕延震，郑新民，任红艳

（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北武汉 430064）

肌内脂肪（Intramuscular Fat，IMF）是影响猪肉质性状的关键因素，研究猪肌内脂肪合成、代谢及调控规律对于优化畜禽体脂比例、改良肉质品质具有重要意义，而深入其代谢规律最为便利快捷的方式是借助于体外分离培养的细胞。脂肪前体细胞最早在1964 年从大鼠的脂肪组织中分离获得。随后科研人员相继建立了3T3-L1、3T3-F442A、SVF 等脂肪前体细胞[1-3]。IMF是机体发育最晚的脂肪，具备特殊的增殖和分化方式[4]，因此体外研究培养的肌内脂肪细胞应来源于肌肉内而不是脂肪组织中的脂肪细胞，这样才可以在研究中更为真实地反映肌内脂肪的分化调控特点，而细胞系的培养通常不能代表在体情况[5-6]。因此有必要建立直接来自于动物体内的细胞培养体系，这样不仅可以直观地反映肌内脂肪的发生和增生的完整过程，而且还能较为精准地研究各种因素对这个过程的调控机制。

脂肪前体细胞原代培养体系已成功地在人、鼠、牛、猪等动物体中构建[7-11]。本实验在总结前期相关研究的基础上，进一步优化操作条件，使用胶原酶消化法成功建立了猪的肌内脂肪前体细胞体外分离培养方法。在细胞分离操作过程中，对组织的活力、酶消化的时间和温度、操作过程的用时、离心力大小及离心次数等方面进行了优化，建立了稳定的原代猪肌内脂肪前体细胞分离方法，为猪脂肪沉积相关基因的功能研究提供了细胞素材。

1 材料与方法

1.1 材料 Ⅱ型胶原酶、胰岛素（Ins）、地塞米松（DEX）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、油红O 染液等购自Sigma 公司；胎牛血清、DPBS 和DMEM/F12 培养基购自Gibco 公司。总甘油三酯测定试剂盒购自北京普利莱生物科技有限公司。

1.2 猪肌内脂肪前体细胞分离 大约克猪背最长肌样品采自湖北省农业科学院畜牧兽医研究所实验猪场出生5 d的纯种大约克猪。在实验室将仔猪进行麻醉处死后将猪体浸泡在新洁尔灭溶液中清洗干净后，取出用75% 酒精擦干。无菌条件下快速采取背最长肌组织，放入添加了高浓度双抗的DPBS 中漂洗3 次，随后在超净工作台内剔除掉表面的血管与结缔组织，剪成0.5～1 mm3的小碎块装入50 mL 离心管中。加入10～15 mL Hank’s 缓冲液，添加46 U/µL 的Ⅱ型胶原酶至终浓度0.2 U/µL，37℃消化2 h。消化完成后，悬液通过74 µm 的细胞滤网进行过滤，滤液转移至离心管中2 000 r/min 离心5 min，用DMEM/F12 漂洗沉淀1 次。加入预热的红细胞裂解液，吹吸混匀，37℃水浴10 min，再用37 µm 的滤网过滤，2 000 r/min 离心5 min，DMEM/F12 继续漂洗1 次。所得细胞沉淀使用培养基完全吹散，滴加入装有完全培养基的细胞瓶中，在37℃，5% CO2的条件下进行培养。由于贴壁速度的差异，肌内脂肪前体细胞约在接种后2 h 即可以贴壁，而其他杂细胞的贴壁速度较慢，因此采用差速贴壁法进行纯化处理。接种培养2 h 后，吸掉瓶中原液，使用DMEM/F12 清洗2 次，加入新的完全培养基继续培养，每3 d 给予新的培养基。

1.3 细胞传代培养 细胞密度达到90%时，吸弃原有培养基，使用DPBS 洗1～2 次，加入0.25% 胰酶室温消化2 min 左右。在倒置显微镜下观察，待细胞开始收缩，彼此分开，立即吸掉胰酶，加入完全培养液终止消化。枪头轻轻吹打细胞，原代分离的细胞较为脆弱而且贴壁力不强，因此在分散过程中应注意避免机械损伤。转移悬液至1.5 mL 离心管，3 000 r/min 离心2 min，去上清，加入适量培养基分散细胞，按照实验所需的接种密度滴加至新瓶中进行传代培养。首次传代后，可适当增大培养基中FBS（Fetal Bovine Serum，胎牛血清）的含量（15%～20%），有利于促进细胞生长。

1.4 细胞冻存 选择生长旺盛以及存活率高的细胞进行冻存。细胞的收集方法同细胞传代步骤，收集好后DPBS 洗1 遍，去除干净上清。加入500 µL 冻存液收集离心管中细胞，转移至冻存管内（提前在管外壁上写好种类、代数、操作者、日期等），注意拧紧管盖，防止后期液氮进入管内。将细胞按照4℃ 30 min，-80℃过夜后转移至液氮的顺序进行缓慢冻存。

1.5 猪肌内脂肪前体细胞诱导分化 待培养板中细胞完全汇合时开始诱导。分化培养基由5 µg/mL Ins（胰岛素）、0.5 µmol/L IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤）和1 µmol/L DEX（地塞米松）组成[12]。细胞分化培养基培养3 d，随后换用含有5 µg/mL Ins 的完全培养基继续培养3 d，之后每3 d 更换新的完全培养基持续培养，直至90% 的细胞出现脂滴。每天观察并记录细胞的形态变化规律。

1.6 油红O 染色鉴定 诱导分化结束后，吸去培养液，用DPBS 轻轻洗3 遍，防止细胞被缓冲液冲掉。使用滤纸沿着培养板侧壁吸干残留在培养孔中的液体，24 孔板每孔加入500 µL 4% 多聚甲醛，室温下放置40 min固定细胞。固定完成后，吸弃多聚甲醛溶液，DPBS 洗2 遍，每孔加入500 µL 0.5%的油红O 工作液，室温染色45 min。期间可在显微镜下进行观察，脂滴颜色逐渐变深。吸去染液，60% 异丙醇浸润10～20 s，DPBS清洗2 遍除去多余染液，使用倒置显微镜观察染色情况并拍取照片。

1.7 细胞甘油三酯含量测定 取诱导分化0、3、6、9、12 d 的细胞，用DPBS 清洗3 次后，按照甘油三酯测定试剂盒（北京普利莱公司）操作说明测定并根据对应公式计算甘油三酯含量。每个诱导时间组设置3 个重复孔，检测540 nm 处的OD 值。

甘油三酯和蛋白浓度均在540 nm 处测定OD 值，绘制标准曲线计算蛋白浓度，以每mg 蛋白浓度对甘油三酯含量进行校正。

1.8 统计分析 使用SPSS 20.0 对处理后的数据进行统计分析，数据显示为3 个独立实验的平均值±标准差。*表示差异显著（P＜0.05）；**表示差异极显著（P＜0.01）。

2 结果

2.1 猪肌内脂肪前体细胞形态学观察 如图1 所示，使用差速贴壁法获得了相对纯净的肌内脂肪前体细胞，分离的细胞接种2 h 后部分贴壁生长，形态较为均一，清洗换液以去除未贴壁杂细胞；原代培养24 h 后可以观察到培养瓶中的细胞形态大部分变为短梭形、多边形或不规则的小三角形；持续培养至72 h，细胞快速增殖加速生长，体积变大，数量增多，汇合度达90% 以上，聚集成放射状单层细胞，形态类似于成纤维细胞样。继续培养，细胞发生密度抑制后停止生长，涡旋状单层紧密排布，不会出现重叠生长的状况。

图1 原代肌内脂肪前体细胞培养2、24、72 h 的形态（×100）

2.2 猪肌内脂肪前体细胞传代培养 使用胰酶消化传代后的细胞2 h 左右即会贴壁，形态与原代细胞基本相同，但细胞的增殖速度明显比原代细胞快。传代次数较少时不会观察到细胞内出现脂滴，但随着细胞的代数增加（9～10 代），肌内脂肪前体细胞较容易出现自发充脂现象，小部分细胞内开始出现微小脂滴，持续培养可观察到脂滴逐渐聚集。

2.3 猪肌内脂肪前体细胞的诱导分化及油红O 鉴定 传代培养的细胞不经诱导只会进行增殖很少发生分化。在诱导分化培养基环境中生长2 d，显微镜下未能观察到明显的脂滴；生长3 d 后细胞体积变大，形状变为不规则的扁平形，还可看到一少部分细胞内开始出现微小的明亮圆粒小脂滴，培养基颜色略微变黄；诱导第3 天开始出现单个脂滴，第6 天后可以看到含有脂滴的细胞有所增多，而且脂滴的大小不均匀，数量变多；诱导12 d后发现充脂的细胞数量显著增加，形成“葡萄串”状脂滴（图2）。

油红O 染色法可以灵敏准确地检测出体外培养的脂肪前体细胞的分化率，常被用于脂肪细胞的鉴定。本实验使用该方法对诱导后的细胞进行染色处理，在显微镜下检测脂滴，观察到细胞内部大小各不同的圆粒脂滴经染色后变为红色，由此可确定本实验成功分离出肌内脂肪前体细胞，且细胞经诱导后已分化为成熟的脂肪细胞（图2）。

图2 肌内脂肪前体细胞的诱导分化及鉴定（×100）

2.4 猪肌内脂肪前体细胞分化过程中甘油三酯含量变化由图3 可见，诱导培养6 d，细胞内甘油三酯含量逐渐增加；培养9 d 的细胞，充脂速度显著增加；继续培养至12 d 的细胞可见甘油三酯含量增加不明显，说明细胞已接近于完全分化，与形态所观察到的结果相吻合。

3 讨 论

影响分离原代脂肪前体细胞的因素有很多，不同研究对取材对象、消化时间、离心力和培养基的选择各有不同。离心过程是影响细胞分离效果的一个重要因素，分离过程中应减少不必要的离心次数，以降低细胞丢失量；同时离心力应控制在合理范围，转数太小时细胞不能充分沉淀，转数太大则会损伤细胞影响接种后的活力。不同物种的脂肪前体细胞离心力和离心时间不尽相同，牛的脂肪前体细胞分离时用186 ×g 离心10 min[13]；分离山羊的脂肪前体细胞时离心条件为2 000 r/min 离心5 min[14]；人的脂肪前体细胞分离时需要在1 000 r/min 离心5 min[15]。郑月英等[16]分离梅山猪脂肪前体细胞时用到的离心条件是1 200 r/min 离心10 min。本实验结果显示，肌内脂肪前体细胞的分离以2 000 r/min 的转数离心分离为最佳，所得细胞数量适宜，活力较强。分离操作过程用时过长会影响细胞的活性，还有可能造成污染，因此在整个操作过程中应尽量缩短用时。

本实验通过几次分离培养操作对比发现，取材对象也是细胞成功分离培养的重要条件。本研究发现，猪脂肪前体细胞理想的取材对象是3～7 d 生理状况良好、健康的新生仔猪，以确保细胞来源的活力。日龄越小越好，大于10 d 的仔猪已不适用于分离猪脂肪前体细胞。采集的背最长肌组织用0.2% Ⅱ型胶原酶在37℃水浴摇床条件下消化2 h，期间取出消化混合液轻轻涡旋几次，有利于组织的分散，提升细胞获得率。虽然消化时长与细胞得率呈正比，但胶原酶会对细胞产生损伤，因此应控制在适当的时长内进行消化。

本实验分离获得的肌内脂肪前体细胞生长状态良好，培养72 h 后，细胞汇合度达即可达90%以上，由分散的短梭形或小三角形转变为单层较为紧密生长的类似成纤维细胞的形态。消化传代培养，可观察到细胞生长旺盛，增殖能力强。相关研究报道，肌内脂肪前体细胞是不容易发生自发分化的[17-18]。目前已经发现多种能够诱导脂肪前体细胞分化的试剂，其中添加Ins、DEX和IBMX 的激素混合物组合是诱导细胞分化的最有效的方法[19-20]。因此通过结合相关文献报道及前期试验摸索，建立以下诱导体系，细胞长满细胞板后，使用含5 µg/mL Ins、0.5 µmol/L IBMX 与1 µmol/L DEX 的 成脂分化培养液培养72 h，换用含5 µg/mL Ins 的完全培养基继续培养72 h，随后每隔3 d 给予新的完全培养基。观察到细胞在诱导3 d 即出现少量小脂滴，随着培养时间的延长，脂滴数量增多体积增大，在9～12 d 形成较多大脂滴，细胞的形态近似于成熟脂肪细胞。通过油红O 染色法对诱导培养的细胞进行鉴定，证实所分离细胞即为肌内脂肪前体细胞。此外，细胞内甘油三酯含量随诱导时间呈时序性增加，该结果与以上观察到的细胞形态变化情况相吻合。

4 结 论

本研究通过经典的胶原酶消化法并结合差速贴壁法进行纯化，成功建立了猪肌内脂肪前体细胞的体外分离培养体系。所分离的细胞纯度较高，增殖和分化能力旺盛。诱导分化鉴定实验证实所分离的细胞为具有典型特征的肌内脂肪前体细胞，细胞传代后依然表现出较高的生长活性，这为后续体外研究猪肌内脂肪代谢以及沉积机理奠定了良好的实验基础。