绵羊生物钟基因Cry 多态性与产羔数的关联分析

2019-12-26陈炜昊田志龙储明星

中国畜牧杂志 2019年12期

陈炜昊，田志龙，孙伟，储明星*

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193；2.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009）

绵羊产羔数是衡量绵羊生产力的重要标准，产羔性状提高将为养羊业带来巨大的经济效益。然而，绵羊产羔性状遗传力低，易受各种环境因素和发育因素影响，使用常规育种手段难以满足现代畜牧业对于产羔性状改良的需求[1]。随着分子生物学技术的迅速发展，标记辅助选择能够从DNA 水平上对影响相关性状的单个基因或染色体片段进行分析，找到与对应性状位点相连锁的标记，对产羔性状等低遗传力性状的遗传改良效率有极大提高[2]。

昼夜节律是指生命活动以24 h 左右为周期的变动，又称近日节律，是生命的基本特征之一，几乎所有多细胞的生物活动都受昼夜节律时钟（生物钟）调控影响[3]。自然状态下，生物钟接受光照、温度等环境信号，调整自身节律保持与外界环境同步[4]。研究表明，绵羊属于季节性繁殖动物，在光照逐渐缩短的秋冬季节开始性腺活动，在冬春之交时结束，绵羊的繁殖过程具有明显的节律性[5]，因此，昼夜节律对于绵羊的繁殖过程有一定的调控作用。

昼夜节律与基因的节律性表达有关，这些基因的表达量常受生物钟调节并且伴随昼夜循环发生规律性变化，维持昼夜节律基因称为生物钟基因[6]。目前哺乳动物中已发现10 种以上的生物钟基因，隐花色素基因（Cryptochrom，Cry）是核心成员之一，其属于植物蓝光受体基因家族和光解酶家族，是唯一的反馈环负调节因子，在生物节律中具有重要作用[7]。研究表明，Cry基因对哺乳动物卵巢功能有一定的影响，小鼠中2 种Cry基因亚型（Cry1、Cry2）的突变会导致生物钟基因Per的节律性丧失[8]。Per基因在雌性哺乳动物卵巢生物钟的调节中起重要作用，参与调控类固醇激素释放、排卵等多项繁殖相关生物学活动[9]，从而影响繁殖功能。综上，推测Cry基因可能对于绵羊繁殖性状也有一定的影响，但目前绵羊上Cry基因与繁殖的相关研究鲜有报道。

本研究针对不同发情模式的绵羊品种（季节性发情和常年发情），利用本课题组前期重测序结果（尚未发表），筛选出与绵羊产羔性状相关的候选基因Cry1基因g.175355119T＞C、g.175357583C＞T 位点与Cry2基因g.74126865C＞T 位点，探讨3 个多态位点与产羔数的关联性，为进一步开展绵羊产羔机理的研究和分子标记辅助育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 血样采集及数据测定 380 只小尾寒羊血液样本采自山东省郓城县诚联小尾寒羊种羊场，101 只湖羊血液样本采自江苏省徐州申宁羊业有限公司，52 只策勒黑羊血液样本采自新疆和田市策勒县，22 只滩羊血液样本采自宁夏盐池县宁夏朔牧盐池滩羊繁育有限公司，21只苏尼特羊血液样本采自内蒙古巴彦淖尔市乌拉特中旗民羊牧业有限责任公司，161 只草原藏羊血液样本采自西藏当雄县，颈静脉采血10 mL，迅速注入EDTA 抗凝管中，-20℃保存，并记录小尾寒羊前三胎次的产羔数。

1.2 DNA 提取使用血液DNA 试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取绵羊血液样本DNA，Nano Drop2000 检测DNA 样本浓度，琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量。

1.3 基因分型对Cry1基因g.175355119T＞C 和g.17535 7583C＞T 与Cry2基因g.74126865C＞T共3个多态位点在常年发情和季节性发情绵羊品种中进行基因分型，采用Sequenom MassARRAY®SNP 技术进行基因型检测[10]。分型样品为DNA，每个样品需要量为20 μL，DNA 浓度为40～80 ng/μL。

1.4 统计分析采用Excel 统计绵羊Cry1、Cry2基因共3 个多态位点的基因型频率、等位基因频率、多态信息含量（PIC）、杂合度（He）和有效等位基因数（Ne），并进行Hardy-Weinberg 平衡检验，配合模型进行最小二乘分析：

其中，yijkl为产羔数的记录值；μ 为总体均值；LSi为第i 个产羔季节的季节效应（i=1，2，3，4）；Pj为第j个胎次的胎次效应（j=1，2，3）；Gk为Cry1/Cry2基因第k 种基因型的基因型效应；eijkl为随机残差效应（服从标准正态分布）。

采用IBM SPSS Statistics 19.0 软件中一般线性模型程序单变量分析法对Cry1、Cry2基因3 个多态位点的不同基因型和记录的产羔数之间的差异显著性进行分析。P＜0.01 表示差异极显著，P＜0.05 表示差异显著，P＞0.05 表示差异不显著。结果以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 多态性分析根据基因分型结果，Cry1基因g.1753 55119T＞C 位点存在CC、CT 和TT 3 种基因型（图1），g.175357583C＞T 位点存在TT、TC 和CC 3 种基因型（图2）；Cry2基因g.74126865C＞T 位点存在CC、CT 和TT 3 种基因型（图3）。

图1 Cry1 基因g.175355119T＞C 位点分型结果

图2 Cry1 基因g.175357583C＞T 位点分型结果

图3 Cry2 基因g.74126865C＞T 位点分型结果

由表1 可知，绵羊Cry1基因g.175355119T＞C 位点基因型频率和等位基因频率在季节性发情、常年发情绵羊品种间差异极显著，且在季节性发情、常年发情绵羊品种中T 均是优势等位基因；g.175357583C＞T位点基因型频率和等位基因频率在季节性发情、常年发情绵羊品种间差异不显著，且在季节性发情、常年发情绵羊品种中C 均是优势等位基因。绵羊Cry2基因g.74126865C＞T 位点基因型频率和等位基因频率在季节性发情、常年发情绵羊品种间差异极显著，且在季节性发情、常年发情绵羊品种中C 均是优势等位基因。

由表2 可知，绵羊Cry1基因g.175355119T＞C 位点和g.175357583C＞T 位点在6 个绵羊品种中均表现为中度多态（0.25＜PIC＜0.5），g.175355119T＞C 位点在6 个绵羊品种中均处于哈代温伯格平衡状态（P＞0.05），g.175357583C＞T 位点在苏尼特羊中处于哈代温伯格不平衡状态（P＜0.05），在其余5 个绵羊品种中则处于哈代温伯格平衡状态（P＞0.05）。绵羊Cry2基因g.74126865C＞T 位点在6 个绵羊品种中均表现为低度多态（PIC＜0.25），该位点在滩羊和草原型藏羊中处于哈代温伯格不平衡状态（P＜0.05），在其余4 个绵羊品种中则处于哈代温伯格平衡状态（P＞0.05）。

2.2Cry1基因与Cry2基因3 个多态位点与小尾寒羊产羔数的关系由表3 可知，Cry1基因与Cry2基因3 个多态位点不同基因型与小尾寒羊不同胎次产羔数之间均无显著关联。

3 讨论

哺乳动物生物钟系统由位于下丘脑视交叉上核（SCN）的中枢生物钟和各个组织中的外围生物钟组成，因此，生物钟基因不仅仅在生物节律中发挥作用，在机体其他生物学功能中也发挥着重要作用[11]。Fahrenkrug等[12]于2006 年首次发现Clock、Cry等核心生物钟基因在卵巢中的节律性表达，证实了卵巢生物钟的存在。随后大量研究表明生物钟基因确实在雌性哺乳动物生殖系统生理过程中起重要作用[13-15]。Cry基因是核心生物钟基因之一，由光介导调控[16]。Cry基因敲除小鼠在光诱导下抑制Per基因表达的能力有所减退或消失[17]，而Per基因表达量的改变会导致雌性哺乳动物的生殖力改变[18]。此外，Cry1和Cry2双突变的小鼠在正常光暗周期条件下表现出正常的节律性，但在全黑暗的条件下失去节律性[19]，综上推测，Cry基因对绵羊等季节性发情的哺乳动物繁殖功能有较大的影响。

本实验中群体遗传学分析发现，Cry1基因g.17535 5119T＞C 位点和g.175357583C＞T 位点在6 个绵羊品种中均表现为中度多态，表明其在6 个绵羊品种中存在较大的选择潜力。Cry2基因g.74126865C＞T 位点在6 个绵羊品种中均表现为低度多态，表明其在6 个绵羊品种中选择潜力较小。Cry1基因g.175357583C＞T 位点在苏尼特羊中处于哈代温伯格不平衡状态，Cry2基因g.74126865C＞T 位点在滩羊和草原型藏羊中处于哈代温伯格不平衡状态，可能是因为自然选择或人工选择对该位点分布影响较大，也可能与本研究选择的羊品种数量较少有关。

表1 Cry1、Cry2 基因3 个多态位点在季节性发情、常年发情绵羊品种中的基因型频率和等位基因频率

表2 Cry1、Cry2 基因3 个多态位点在不同绵羊品种中的群体遗传学分析

表3 Cry1 基因与Cry2 基因3 个多态位点各基因型小尾寒羊产羔数

突变能显著改变动物表型，1982 年Davis 等在澳大利亚布鲁拉绵羊品种发现的FecB 突变，就是在BMPRIB基因的第746 位发生A＞G 突变导致的，在1989 年时该突变正式被命名为FecB基因。1 个FecB基因拷贝可以增加排卵数1.3～1.6 枚和产羔数0.9～1.2只，2 个FecB基因拷贝可以增加排卵数2.73 枚和产羔数1.1～1.7 只[20]。Vitaterna 等[8]研究表明，Cry2突变会导致自由运动周期的延长，Cry1突变则表现出自由运动周期的缩短，若Cry1和Cry2均发生突变，则生物钟基因Per的节律性丧失，因此Cry基因多态性可能同样对于绵羊繁殖有一定的影响，但目前相关报道较少，故探索绵羊Cry基因测序寻找其与产羔性状关联的SNP位点尤为重要。

绵羊Cry1基因g.175355119T＞C 和g.175357583C＞T位点发生于第3 外显子，Cry2基因g.74126865C＞T 位点发生于第15 外显子。3 个多态位点均属于错义突变，Cry1基因g.175355119T＞C 位点导致第175 位氨基酸由异亮氨酸变为蛋氨酸，g.175357583C＞T 位点导致第126 位氨基酸由缬氨酸变为异亮氨酸，Cry2基因g.74126865C＞T 位点导致第325 位氨基酸由丙氨酸变为缬氨酸。错义突变会导致蛋白变化并进一步引起动物表型的变化[21]，因此，3 个多态位点的具体功能有待于进一步研究。