水稻Histone3同源蛋白序列和基因表达特性分析

胡明瑜 白文钦 潘晓雪 吴红 雷开荣

摘   要   组蛋白Histone3是表观遗传调控的重要靶蛋白。同一物种中往往有多个Histone3同源基因，这些同源基因在生物学功能上是否有差异尚不清楚。本研究对水稻的8个Histone3同源蛋白作了比较，发现在N端序列差异相对较大。在“秀水03”和“日本晴”中，8个Histone3同源基因的表达特性相似，其中LOC_Os06g04030和LOC_Os03g27310在大部分组织器官中组成型表达，而其他Histone3同源基因的表达水平较低;部分同源基因在种子、花粉囊和雌蕊等组织器官中特异性高表达。进一步分析这些同源基因的上游调控序列，发现具有大量的生长调节剂和环境信号调控元件，以及组织特异性表达相关元件，并且不同基因中的调控元件有一定差别，如在LOC_Os04g34240和LOC_Os06g04030中含有生长素应答元件，而在LOC_Os05g41080和LOC_Os03g27310中含有赤霉素应答元件。这些结果表明，水稻Histone3同源基因不仅编码的氨基酸序列有差异，而且在表达调控上也有较大差别，暗示这些基因在生物学功能上可能有所差异。

关键词    水稻;组蛋白;OsHistone3;基因表达;表观遗传调控

中图分类号：S511.5;Q78    文献标志码：A    DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.31.001

表观遗传调控在植物适应不同生物逆境的过程中发挥着重要作用[1]。近几年，越来越多的证据表明，植物抗病性与DNA/RNA甲基化、非编码RNA表达和组蛋白修饰等表观遗传调控密切相关。例如，在拟南芥中，利用siRNAs （small interference RNAs）介导RNA依赖性的DNA甲基化，对DNA特定位点进行修饰，可增强对病毒的防御能力[1]。在侵染拟南芥的溴病毒（bromovirus）中，腺嘌呤甲基化程度与拟南芥抵抗侵染的能力相关，表明RNA水平的甲基化也与抗病性相关[2]。

组蛋白修饰是表观遗传调控的重要方式，包括组蛋白乙酰化、甲基化和泛素化等。擬南芥突变体Atelp2和Atelp3-10对十字花科黑斑病菌（Pseudomonas syringae pv. maculicola）等病原菌高度敏感，研究发现，受到病原体侵染时，AtELP2和AtELP3蛋白促进防御应答基因表达，而这与AtELP2和AtELP3的组蛋白乙酰转移酶活性有关[3-4]。拟南芥ATX1蛋白具有组蛋白甲基转移酶活性，能够激活拮抗水杨酸和茉莉酸甲酯信号的WRKY70基因表达，并维持该基因核小体的Histone3组蛋白在K4位的三甲基态;同时，水杨酸信号应答基因PR1和茉莉酸甲酯信号应答基因THI2.1的核小体也是ATX1蛋白的作用靶点[5]。拟南芥组蛋白甲基转移酶SDG8（set domain group 8）通过调控茉莉酸甲酯和乙烯信号相关基因，来防御真菌病原侵染;其功能缺失突变体sdg8-1对芸薹生链格孢菌（Alternaria brassicicola）和灰葡萄孢菌石竹变种（Botrytis cinerea）等病原菌的防御能力降低[6]。进一步研究发现，SDG8和SDG25调控损伤相关内源性肽pep1、细菌鞭毛蛋白flg22和效应物诱发的植物免疫反应和系统性抵抗反应[7]。在玉米中，对赤藻茎腐病抗性与ZmCCT基因表达水平相关;在感病株系中发现ZmCCT基因上游调控序列中插入转座子元件，使组蛋白激活标签H3K4me3被删除，并引入大量甲基化的GC序列，导致ZmCCT基因在病原菌侵染时无法诱导表达[8]。黄单胞杆菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）侵染水稻时，诱导15个组蛋白赖氨酸去甲基化酶（Jumonji C）基因表达;在jmj704突变株中H3K4me2/3标记水平显著增加，表明JMJ704蛋白可能调控H3K4me2/3的去甲基化[9]。此外，用大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）毒素处理拟南芥组蛋白H2B单泛素化相关突变体（hub1-4、hub2-2、ubc1-1、hub1-4/hub2-2、ubc1-1/ubc2-2等），发现组蛋白H2B单泛素化在防御反应中参与调控了微管的动力学特性[10]。这些证据表明在受到病原侵染时，植物的防御反应与组蛋白修饰紧密相关，开展组蛋白及其修饰酶的研究对于揭示植物抗病机理有重要意义。

已有研究表明，组蛋白Histone3具有多种修饰酶（如甲基化酶ATX1、SDG8、SDG25和去甲基化酶家族JMJCs等）及多个修饰位点（如H3K4、H3K9和H3K27等），而且Histone3的不同修饰参与调控植物生长发育和对病原菌的防御反应[11]，这说明Histone3是植物进行表观遗传调控的重要靶蛋白和纽带，在植物生长发育调控和抵抗病原菌方面具有重要作用;不过，目前对Histone3基因自身的表达特性还研究较少。为了解Histone3基因是否可能在转录水平参与植物表观遗传调控，我们对水稻Histone3同源基因的编码蛋白进行了比较，并对基因表达特性进行分析，发现水稻中有8个Histone3同源基因，根据编码蛋白质的同源性可分为4组，同源蛋白间N端序列差异相对较大。表达分析显示，8个Histone3同源基因在“秀水03”和“日本晴”中表达特性相似，其中LOC_Os06g04030和LOC_Os03g27310在不同组织器官中组成型表达，而其他Histone3同源基因表达水平较低，LOC_Os12g22680、LOC_Os05g41080和LOC_Os02g25910分别在种子、花粉囊和雌蕊中相对高表达。对Histone3同源基因上游调控序列分析，发现存在多种生长调节剂的信号调控元件和环境响应元件，同时还有胚乳、茎尖、分生组织等部位特异表达元件。水稻Histone3同源基因之间的上游调控序列包含的顺式调控元件也存在差异，如生长素应答元件主要在LOC_Os04g34240和LOC_Os06g04030中，而赤霉素应答元件主要在LOC_Os05g41080和LOC_Os03g27310中，这表明水稻Histone3同源基因在生物学功能上可能有所差异。综合而言，编码Histone3蛋白同源性高的基因表达特性相似，部分水稻Histone3基因具有组织表达特异性。这为进一步探索Histone3同源蛋白在调控植物生长发育和防御反应中的不同作用提供了参考。

1 材料与方法

1.1   试验材料

1.1.1 植物材料

“秀水03”（Oryza sativa L. “Xiushui 03”），是逆境农业研究重庆市重点实验室保存的特早熟晚粳稻品种;“日本晴”（Oryza sativa L. “Nipponbare”），是国际水稻基因组计划中的典型粳稻基因组供体，完成了全基因组测序，是常用的水稻研究材料。

1.1.2 试剂

Trizol法总RNA提取试剂盒，购自赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 水稻Histone3同源蛋白序列分析

利用Lasergene的MegAlign程序分析水稻Histone3同源蛋白序列。采用Clustal W方法进行计算，参数为软件默认。

1.2.2 “秀水03”转录组测序

“秀水03”种子萌发2周后，取15棵幼苗幼根，液氮研磨，用Trizol法提取总RNA备用;随机抽取15棵田间正常生长的“秀水03”植株，分别用解剖刀取第二、三片完全展开叶，取第二、三节茎，取开花前和开花后果穗，液氮研磨，用Trizol法提取总RNA备用;从根、茎、叶和穗提取的总RNA样品检测合格后，由上海美吉生物医药科技有限公司做转录组测序。

2 结果与分析

2.1 水稻Histone3同源蛋白序列比较

表观遗传学研究认为，Histone3蛋白的序列变异和修饰与基因表达调控关系密切。为了解水稻中Histone3同源蛋白序列差异，在国家水稻数据中心（http：//www.ricedata.cn/index.htm）查找到8个水稻Histone3同源基因，基因编号分别为LOC_Os11g05730、LOC_Os12g22680、LOC_Os06g06510、LOC_Os05g41080、LOC_Os04g34240、LOC_Os06g04030、LOC_Os03g27310和LOC_Os02g25910，对應蛋白质分别标记为Os11g05730、Os12g22680、Os06g06510、Os05g41080、Os04g34240、Os06g04030、Os03g27310和Os02g25910。

用Clustal W软件对蛋白质序列同源性做了分析（见图1A）。结果显示，Os06g04030、Os03g27310和Os02g25910的蛋白质同源性较高，其中Os06g04030和Os03g27310蛋白质序列相同，Os02g25910与前两者的序列一致性达到85.3%。Os11g05730、Os06g06510和Os04g34240编码的蛋白质同源性较高，其中Os11g05730和Os06g06510蛋白质序列相同，Os04g34240蛋白在N端多出138个氨基酸残基，其余部分序列与Os11g05730和Os06g06510蛋白质序列相同。Os12g22680和Os05g41080编码的蛋白质与其他Histone3同源蛋白序列差异相对较大，序列一致性在57%～82%。根据水稻Histone3蛋白同源性分析结果构建进化树（图1B），可将8个水稻Histone3蛋白分成4组（组1：Os11g05730、Os06g06510和Os04g34240;组2：Os06g04030、Os03g27310和Os02g25910;组3：Os12g22680;组4：Os05g41080）。这说明水稻中Histone3同源蛋白在序列上存在一定差异，N端序列差异相对较大。

2.2 水稻“秀水03”中Histone3同源基因表达特性

为了解水稻Histone3同源基因的表达特性，利用特早熟粳稻品种“秀水03”的根、茎、叶和穗的转录组数据，分析Histone3同源基因表达情况。结果表明，8个Histone3同源基因均检测到转录本（见图2）。其中组2的LOC_Os06g04030和LOC_Os03g27310在根、茎、叶和穗中组成型表达，FPKM（Fragments Per Kilobase per Million）值均在200以上;而LOC_Os02g25910在根、叶和穗中表达量极低，在茎中相对高表达。在组1中LOC_ Os11g05730、LOC_ Os06g06510和LOC_ Os04g34240表达特征相似，LOC_Os11g05730和LOC_Os06g06510在幼根和叶中表达相对较高，LOC_Os04g34240在幼根中表达相对较高。组3的LOC_Os12g22680在果穗中高表达，在其他部位表达量极低。组4的LOC_ Os05g41080在幼根和茎中相对高表达。这些数据初步表明“秀水03”中Histone3同源基因表达水平差异较大，部分Histone3同源基因存在组织表达特异性。

2.3 “日本晴”中Histone3同源基因表达特性

利用RGAP数据库[12]（The MSU Rice Genome Annotation Project Database and Resource， http：//rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）分析水稻Histone3同源基因的表达模式。结果表明，在“日本晴”中，组2的LOC_Os06g04030和LOC_Os03g27310在不同发育时期的芽、叶、胚、种子、果穗、花粉囊、雌蕊等部位组成型高表达（见图3A），其中LOC_Os06g04030在雌蕊中的FPKM值高达934;而LOC_Os02g25910在各组织器官表达量较低，在花粉囊中相对高表达（图3B）;组1的LOC_Os11g05730、LOC_Os06g06510和LOC_Os04g34240表达特征相似，在不同发育时期的果穗、雌蕊、芽、种子（5DPA）和胚（25DPA）等部位高表达;组3的LOC_Os12g22680在种子（5DPA）中表达量相对较高;组4的LOC_Os05g41080在雌蕊和果穗中表达量相对较高（图3B）。这些数据进一步说明，水稻Histone3同源基因的表达水平差异较大，部分Histone3同源基因在雌蕊、花粉囊和种子（5DPA）等部位特异表达。

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（責任编辑：丁志祥）