芪丹利心丸对心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠心肌纤维化的影响*

2019-12-25石斌豪黄鈺婷徐宗佩樊官伟

天津中医药 2019年12期

石斌豪，黄鈺婷，徐宗佩，樊官伟

（1.天津中医药大学，天津 301617；2.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193）

慢性心力衰竭（CHF）是由于心脏结构或功能异常导致心室充盈或射血能力受损的复杂临床综合征，以呼吸困难、乏力及液体潴留为主要表现。CHF的发病率不断上升，急性心肌梗死是导致CHF 发病的主要疾病之一，而心肌纤维化是CHF 发病的主要原因之一，特别是心肌梗死导致的CHF 纤维化更加明显[1-2]。转化生长因子-β1（TGF-β1）已被证实在心肌纤维化中扮演着重要角色，通过介导TGF-β1/Smads 信号通路将心肌成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，持续促进细胞外基质（ECM）的沉积，导致心脏刚性增加、收缩舒张功能障碍[3]。

芪丹利心丸是天津中医药大学第一附属医院心内科防治慢性心力衰竭的专利方（专利号：ZL 201110413471.1），是基于CHF 中医病因病机特点，依据益气活血利水的治则创制，对于CHF 本虚标实、虚实夹杂的证候特点具有针对性，在临床应用中有着良好疗效[4]。利用益气活血利水法治疗CHF已有诸多报道[5-8]，在心力衰竭治疗指南指导下联合益气活血利水方剂能提高心功能、缓解心力衰竭程度及心室重构，但对益气活血利水中药的作用机制研究尚不充分，本研究通过芪丹利心丸干预CHF 大鼠的实验研究，以期阐释其改善心功能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物无特定病原体（SPF）健康Sprague-Dawley 雄性大鼠120 只，体质量为220～240 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证编号：SCXK（京）2012-0001。

1.2 动物模型制备及分组用5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，颈部及胸前备皮，腹部朝上，固定四肢及头部。经口气管插管连接小动物呼吸机辅助呼吸，胸前手术于第3、4 肋间打开胸腔，暴露心脏。于显微镜下确定左冠状动脉前降支位置（肺动脉圆锥与左心耳交界处），进针深度约1.5 mm，结扎后心室前壁变苍白，室壁运动明显减弱。用棉球吸除胸腔内液体，挤出胸腔内气体，逐层缝合肌肉及皮肤，观察有自主呼吸后拔除插管。另设假手术组（Sham，10 只），在冠状动脉前降支下只穿线不进行结扎。将冠状动脉前降支结扎术后存活大鼠（86 只，术中死亡24 只）继续饲养4 周后利用小动物超声仪Vevo2100 测定左室射血分数（LVEF），以LVEF 0.38～0.50 为CHF 制模成功，CHF 模型成功率约52%（45 只），剔除未达到标准的大鼠后，按随机数字表法将大鼠分为模型组（Model，术后给予等体积生理盐水）、芪丹利心丸（天津中医药大学第一附属医院提供，每克药粉相当于3.45 g 生药）低[QD-L，1.1 g/（kg·d）]、中[QD-M，2.2 g/（kg·d）]、高[QD-H，4.4 g/（kg·d）] 剂量组和缬沙坦组[诺华制药有限公司，Val，10 mg/（kg·d）]，各组均连续灌胃4 周。药物干预后每组各剩余9 只。

1.3 观察指标及方法

1.3.1 心动超声及血流动力给药4 周后，各组随机取6 只大鼠称质量，异氟烷麻醉，仰卧位固定，利用超声心动仪Vevo2100 及左心室压力-容积环检测大鼠LVEF、左室短轴缩短率（LVFS）、左室收缩末期内经（LVESD）、左室内压上升或下降最大速率（±dp/dt max）等心脏功能指标。

1.3.2 蛋白组学指标检测将剩余大鼠（各组3 只）称质量，异氟烷麻醉，仰卧位固定，在腹主动脉取血后，经腹主动脉用生理盐水灌注冲洗，然后剪取大鼠心脏，除去心脏表面的血渍后用滤纸吸干水分称质量，再根据不同实验目的随机每组各取3 只用于心脏病理观察及相关蛋白组学指标检测：1）取完整心脏组织置于4%多聚甲醛水溶液中固定，室温保存备用于病理形态学实验。2）取心脏组织包裹于锡箔纸放入冻存管中，液氮速冻30 min 后，转存入-80 ℃冰箱保存，用于反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质免疫印迹实验（Western Blot）。

1.3.2.1 病理组织观察将剪取的完整心脏置于4%多聚甲醛水溶液固定1 周，再经改刀，组织脱水，常规石蜡包埋，4 μm 切片，烤片；然后进行Masson染色。将石蜡切片梯度乙醇脱蜡至水，经铁苏木5 min、丽春红酸性品红5 min、磷钼酸5 min、苯胺蓝5 min、1%醋酸2 min，95%乙醇分化，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，按照标准操作规范，在倒置显微镜下观察大鼠心肌纤维化情况。

1.3.2.2 用RT-PCR 检测各组大鼠胶原蛋白（CollagenⅠ和Ⅲ）的mRNA 剪取大鼠心肌梗死边缘区适量心脏组织，用TRIzol 法提取总RNA，然后通过反转录试剂盒将各组mRNA 反转录为cDNA。最后用RT-PCR 检测目的基因mRNA 表达水平变化情况。所用引物由上海生物工程技术服务有限公司合成见表1。

表1 用于实时RT-PCR 的引物序列Tab.1 Primer sequences for real-time RT-PCR

1.3.2.3 用Western Blot 检测各组大鼠TGF-β1/Smads 的蛋白表达提取大鼠心脏组织蛋白，二喹啉甲酸法（BCA）试剂盒检测各组大鼠心脏蛋白浓度，加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液并95 ℃水浴10 min，使蛋白变性，聚偏氟乙烯（PVDF）转膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h。一抗浓度为TGF-β1（1∶1 000，Proteintech，中国）、Smad3（1∶1 000，Proteintech，中国）、Smad7（1∶400，Boster，中国）、三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH，1 ∶1 000，Proteintech，中国）。使用VersaDoc 5000MP 多功能成像系统曝光成像，Quantity one 软件进行图像分析。

1.4 统计学方法使用SPSS 22.0 统计软件分析数据，符合正态分布的计量数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较若方差齐采用LSD 法，若方差不齐采用Dunnett’s T3 法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芪丹利心丸对心肌梗死后CHF 大鼠心功能的影响超声心动图结果显示（图1、表2），模型组心室腔较假手术组明显扩张。左心室心室律减弱，收缩功能发生障碍，而缬沙坦组和芪丹利心丸组上述情况明显改善。与假手术组比较，模型组LVEF、LVFS、+dp/dt max 均显著降低，室间隔厚度（IVST）明显变薄，LVESD 显著增厚，-dp/dt max 水平显著升高。与模型组比较，缬沙坦组和芪丹利心丸组LVEF、LVFS、+dp/dt max 均升高，IVST 形态趋于正常，LVESD 显著变薄，-dp/dt max 降低。结果提示芪丹利心丸能够改善心功能、缓解心力衰竭大鼠心室重构进展，其中LVEF、LVFS、-dp/dt max 的改善以芪丹利心丸中剂量组效果更为明显，而芪丹利心丸高剂量组改善IVST、LVESD、+dp/dt max 较其他给药组效果更明显。

图1 心肌梗死后CHF 大鼠超声心动图Fig.1 Echocardiography of CHF rats after myocardial infarction

表2 各组大鼠心功能变化（x±s）Tab.2 Changes in cardiac function of each group of rats（x±s）

2.2 芪丹利心丸对心肌梗死后CHF 大鼠心肌纤维化的影响 Masson 染色显示：心肌纤维呈红色，胶原纤维呈蓝色。假手术组心肌细胞排列整齐，细胞间质未见明显蓝色胶原纤维；模型组在心肌梗死边缘区心肌细胞排列紊乱、心肌细胞肥大，有大量蓝色胶原纤维沉积，梗死边缘区纤维化面积较大；芪丹利心丸各组蓝色胶原纤维多呈分枝状分布，蓝染面积较模型组都有不同程度的减少，尤以芪丹利心丸中剂量组较为显著。说明芪丹利心丸具有降低心肌细胞纤维化的功能。见图2。

2.3 芪丹利心丸对病理性心肌胶原蛋白沉积的影响模型组CollagenⅠ和Ⅲ的mRNA 表达均较假手术组显著升高，芪丹利心丸各组CollagenⅠ和Ⅲ的mRNA 表达较模型组显著下降（P＜0.05），见图3。

2.4 芪丹利心丸对TGF-β1/Smads 蛋白表达的影响模型组TGF-β1 蛋白表达较假手术组显著升高（P＜0.01），而芪丹利心丸各组TGF-β1 蛋白表达水平较模型组显著降低（P＜0.05），并且芪丹利心丸明显减少TGF-β1 下游信号分子Smad3 表达（P＜0.05），另一方面，提高抑制型蛋白Smad7 的表达，见图4。

图2 光镜下各组心肌组织纤维化改变（×200）Fig.2 Changes in myocardial fibrosis in each group under light microscopy（×200）

3 讨论

心肌损伤（如心肌梗死）往往会使未死亡的心肌细胞适应性改变和ECM 产生，导致心室的病理性重塑，心室收缩和舒张功能障碍[9]，主要病理特征为心室增大和LVEF 下降，且随着时间的推移不断恶化，LVEF 降低的心力衰竭是目前临床主要常见心力衰竭类型[10]，另一方面，CHF 的中医病机可以概括为：心气虚—血瘀—水停—（心）阳虚（心气虚加重），而且益气活血利水法在临床研究已被证实能提高临床疗效、LVEF、每搏输出量、6 min 步行距离及患者生活质量；降低左室舒张末期内径（LVEDD）、脑钠肽（BNP）、N 末端前脑钠肽（NT-proBNP）及C-反应蛋白（CRP）[11-16]，说明益气活血利水药物能起到改善心功能、延缓因心肌纤维化而导致心力衰竭恶化的作用。实验结果也表明心肌梗死后CHF 大鼠LVEF、LVFS 明显下降，心室腔扩大，收缩功能障碍，而芪丹利心丸可以改善模型大鼠心功能，缓解心室重构，对于心力衰竭患者可能更有针对性。

芪丹利心丸是以黄芪、党参、丹参、葶苈子等益气活血利水药物化裁而成，黄芪、党参为君补益脾、肺生化之气，丹参活血化瘀为臣，另辅以葶苈子等利水养阴，临床研究表明其具有改善心室重构的作用，但机制仍未明确。TGF-β1/Smads 在组织纤维化进展中扮演着重要角色，可涉及心、肺、肝、肾等组织纤维化病变[17-19]。其中，心肌梗死后死亡心肌细胞激活免疫反应，诱导细胞因子和趋化因子的表达，使中性粒细胞和单核细胞向梗死区域募集浸润，激活巨噬细胞等保护机制，巨噬细胞能分泌TGF-β1、TGF-β1 与TGF-β 受体I 型和II 型结合，可激活TGF-β1/Smads 通路，促使心肌成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，在CHF 进展中持续产生ECM，Ⅲ型胶原增加并逐步被刚性Ⅰ型胶原逐渐取代[2]。本研究显示，心肌梗死后CHF 大鼠纤维化水平明显加剧，Ⅰ/Ⅲ型胶原沉积增加，尤其以Ⅰ型胶原显著，心肌组织TGF-β1 蛋白水平升高，下游受体调节Smad3 升高，抑制型Smad7 降低，TGF-β1/Smads 与纤维化水平呈正比，说明心肌梗死后CHF 大鼠TGFβ1/Smads 处于激活状态并持续促进ECM 沉积，而益气活血利水中药芪丹利心丸可能通过抑制TGF-β1/Smads 信号通路，降低TGF-β1 及下游信号Smad3表达，增强Smad7 的抑制作用，使病理性胶原合成减少，延缓心室重构，缓解慢性心力衰竭进展。