急性创伤性完全性脊髓损伤患者肠道菌群多样性研究

张洁，李建军，张超，杨德刚，杨明亮，杜良杰，高峰，申敏鑫

1.首都医科大学康复医学院，北京市 100068；2.中国康复研究中心北京博爱医院脊柱脊髓神经功能重建科，北京市 100068；3.北京脑重大疾病研究院神经损伤与修复研究所，北京市 100068；4.北京市神经损伤与康复重点实验室，北京市 100068

急性脊髓损伤(acute spinal cord injury,ASCI)是一种常见的严重的中枢神经系统疾病，具有高发生率、高死亡率、高致残率和高耗费性的特点[1-3]。这些患者的早期存活率已经显著提高，但他们的生活质量仍然不能令人满意。在ASCI 患者面临的问题中，神经源性肠道功能障碍(neurogenic bowel dysfunction,NBD)是一个重大的生理和心理问题，会严重影响患者的生活质量[4-5]。

人类肠道由数以千计不同的细菌物种定居，它们的数量和遗传含量分别是宿主的1倍和150倍[6]。细菌对于正常消化、营养吸收以及细胞的发育、新陈代谢和功能都至关重要[7-8]。肠道菌群失调的常见原因包括抗生素使用、长期应激和胃肠功能障碍。大多数急性完全性脊髓损伤患者的肠道通过时间改变，肠黏膜功能减弱，导致肠道中的菌群移位。抗生素的使用也会影响肠道微生态系统[9-10]。因此，肠道菌群失调可能发生在脊髓损伤患者中。

本研究对急性创伤性完全性脊髓损伤患者和健康人的肠道微生物进行比较，探讨肠道微生物与血清生物标志物之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017 年5 月至2018 年5 月在北京博爱医院住院治疗的创伤性完全性脊髓损伤患者，符合美国脊柱损伤协会(American Spinal Injury Association,ASIA)残损分级的诊断标准[11]。

患者组纳入标准：①完全性脊髓损伤(脊髓损伤ASIA 残损分级A 级)；②患者受伤时间为6 个月内；③年龄18～60 岁；④创伤性胸段脊髓损伤。患者组排除标准：①无法完成问卷调查；②入组前1 个月内抗生素或益生菌使用史；③高血压、糖尿病等慢性疾病病史；④肝炎、结核等传染病和免疫代谢疾病病史；⑤酗酒史。

对照组纳入标准：①年龄18～60岁；②医院护工、陪护患者的家属及医院的医生、护士。

共77 例受试者入组，其中对照组33 例，患者组44 例。对照组中男性17 例，女性16 例，平均(39.8±8.7)岁。患者组男性36 例，女性8 例，平均(43.5±9.3)岁；T1～T4损伤21 例，T5～T12损伤23 例；受伤原因中车祸占40.9%，高处坠落占36.3%，重物砸伤占20.5%，挤压受伤占2.3%；大部分患者(33 例)排便方式为利用甘油灌肠剂，其次为手指刺激肛门或挤压、按摩腹部；20 例患者每天排便，其余每周2～6 次；34例患者排便时间0～30 min，10 例排便30～60 min；12例排便时会有伴随症状，其中3例排便时会伴随头痛，9 例出汗，其余32 例没有伴随症状；NBD 评分为(8.23±4.4)分。

两组年龄无显著性差异(P>0.05)。见表1。本研究经中国康复研究中心伦理委员会批准(No.CRRCIEC-RP-SQ-006-01)。

表1 两组一般资料比较

1.2 方法

收集受试者的临床数据和新鲜粪便标本。在提取粪便基因组DNA 后，扩增16S rDNA 的V3-V4 区域，并使用Illumina MiSeq 平台分析和比较两组肠道微生物群。使用最新版本的国际脊髓损伤肠功能基础数据集收集所有患者的肠功能核心数据[12-13]。

1.2.1 样本收集

1.2.1.1 大便采样

共收集77份新鲜大便标本，将粪便封装后置于液氮罐中，送至实验室。转移并保持在-80 ℃的冷冻箱中进行冷冻保存。

1.2.1.2 血液及尿液采样

77 例受试者中有27 例患者和23 例对照者提供了血液标本及尿液标本。血液标本分析丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、尿素(UREA)、葡萄糖(glucose,GLU)、肌酐(creatinine,CR)、尿酸(uric acid,UA)、总胆固醇(total cholesterol,Tch)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein,HDL)和低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein,LDL)。尿液标本分析尿液中白细胞(urinary infection,UI)。

1.2.2 DNA抽提和PCR扩增

根据E.Z.N.A.®soil 试剂盒(美国OMEGA BIOTEK 公司)说明书进行总DNA 抽提，DNA 浓度和纯度利用NanoDrop2000 进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 提取质量；用338F(5'-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3')和806R(5'-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3')引物对V3～V4 可变区进行PCR扩增。

扩增程序：95 ℃预变性2 min，25 个循环(95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，最后72 ℃延 伸5 min(PCR 仪：ABI GeneAmp®9700 型)。扩增体系20 μl，5×FastPfu 缓冲液4 μl，2.5 mmol/L dNTPs 2 μl，5 μmol/L 引物0.8 μl，FastPfu 聚合酶0.4 μl；DNA模板10 ng[14]。

1.2.3 Illumina Miseq测序

使用2%琼脂糖凝胶回收PCR 产物，利用Axy-Prep DNA Gel Extraction Kit(美国AXYGEN BIOSCIENCES 公司)进行纯化，Tris-HCl 洗脱，2%琼脂糖电泳检测。

利用QuantiFluor™-ST(美国PROMEGA 公司)进行检测定量。根据Illumina MiSeq 平台(美国ILLUMINA公司)标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2×300 的文库。利用Miseq PE300 平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。

1.2.4 数据处理

原始测序序列使用Trimmomatic 软件质控，使用FLASH 软件进行拼接：①设置50 bp 的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，去除质控后长度低于50 bp 的序列；②barcode 需精确匹配，引物允许2个碱基的错配，去除模糊碱基；③根据重叠碱基overlap将两端序列进行拼接，overlap需大于10 bp；去除无法拼接的序列。

使用的UPARSE软件(Version 7.1)，根据97%相似度对序列进行OTU(Operational Taxonomic Units,操作分类单位)聚类；使用UCHIME软件剔除嵌合体。

利用RDP classifier 对每条序列进行物种分类注释，比对Silva 数据库(SSU123)，设置比对阈值为70%[15]。

1.3 生物信息学

使用QIIME 1.9.0 处理测序读数。使用Wilcoxon秩和检验来鉴定不同标记，使用LDA 对LEfSe分析中的每个特征进行评分。基于97%的序列相似性，用QIIME计算α多样性指数。

通过unweighted-uniFrac 或binary-jaccard 方法测量β 多样性。进行分层聚类，并使用Spearman 等级相关系数作为距离度量和在R 统计包中开发的定制脚本生成热图。

使用Metagenomic Profiles 统计分析软件包(版本2.1.3)进一步分析输出文件[16]。

1.4 统计学分析

使用SPSS 23.0 数据分析程序和Metagenomic Profiles 统计分析软件进行统计分析。对于连续变量，应用独立的t检验、Welcht检验、Mann-WhitneyU非参数检验。显著性水平α双侧=0.05。

2 结果

2.1 生化指标

患者组GLU、UA、TG、Tch、LDL 和UI 均高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 两组生化指标对比

2.2 生物学信息

2.2.1 α多样性

共得到3 904 587 个序列。经过抽平后共识别了794个OTU。OTU 的Good覆盖率为99.9%。与对照组比较，患者组菌群覆盖率(coverage 指数)在OTU 水平(P=0.041)(图1A)和属水平降低(P=0.019)(图1D)，在属水平，患者组代表群落丰富度的sob 指数(P=0.011)(图1B)和ace指数(P=0.018)增高(图1C)。

2.2.2 β多样性

在OTU 水平的主坐标分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)(图2A)和非度量多维尺度分析(nonmetric multidimensional scaling,NMDS)(图2B)及在属水平的NMDS分析(图2C)显示，两组间细菌群落组成存在显著差异。相似性分析结果显示，两组组间差异显著大于组内差异(adonis，R=0.40,P=0.001)(图2D)。

图1 两组微生物α多样性对比结果

图2 两组微生物β多样性对比结果

2.2.3 两组物种差异性

在门水平排名前10的物种中，在患者组和对照组中主要的物种是Firmicutes(厚壁菌门)和Bacteroidetes(拟杆菌门)。与对照组比较，患者组Bacteroidetes(拟杆菌门)减少(P<0.05)；Actinobacteria(放线菌门)、Proteobacteria(变形菌门)、Verrucomicrobia(疣微菌门)、Synergistetes(互养菌门)、Saccharibacteria(螺旋体菌门)和Cyanobacteria(蓝藻菌门)明显增多(P<0.05)。见图3A。

在排名前15 的属种中，有10 个物种在组间存在显著性差异(P<0.05)。在对照组中明显增高的物种为Bacteroides(拟杆菌属)、Faecalibacterium(粪杆菌属)、[Eubacterium]_rectale_group(直肠真杆菌属)、Megamonas(巨单胞菌属)、Roseburia(罗氏菌属)(P<0.05)。在患者组中明显增高的菌群有Bifidobacterium(双歧杆菌属)、Escherichia-shigella(大肠杆菌志贺菌)、Blautia(布劳特氏菌属)、[Eubacterium]-coprostanoligene 和Akkermansia(阿克曼菌属)(P<0.05)。见图3B。

图3 两组菌群物种差异性比较

2.2.4 肠道微生物和生化标志物关联性

典型关联分析(canonical correlation analysis,CCA)显示，GLU(P=0.013,r2=0.2318)，LDL(P=0.047,r2=0.1185)显著影响门水平的群落组成。在属水平，GLU(P=0.001,r2=0.8204)、TG(P=0.028,r2=0.3831)和Tch(P=0.001,r2=0.3375)、LDL(P=0.001,r2=0.5053)、UI(P=0.02,r2=0.2006)显著影响群落的组成。血清生物标志物GLU、LDL、TG 和Tch 与细菌群落结构有相关性(P<0.05)。

不同环境因素与两组群落组成的相关热图分析表明，在前10 种门水平，Firmicutes 与年龄(AGE)呈负相关，与UA 呈正相关(P<0.05)；Bacteridetes 与UREA、LDL、TG、UI、GLU、AST、ALT 呈负相关(P<0.05)；Proteobacteria与TG呈正相关(P<0.05)。见图4A。

总丰度水平前15的属中，ALT与Faecalibacterium和[Eubacterium]_rectale_group 呈负相关(P<0.05)，与Subdoligranulum、Escherichia-Shigella、Blauti、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group 和 norank_f__Ruminococcaceae呈正相关(P<0.05)；AST 与Lachnoclostridium 呈负相关(P<0.05)，与Subdoligranulum、Blautia 和[Eubacterium]_coprostanoligenes_group呈正相关(P<0.05)；UREA 与Bacteroides、Faecalibacterium和Roseburia 呈负相关(P<0.05)，与Prevotella_9 呈正相关(P<0.05)；GLU 与Bacteroides、Faecalibacterium 和[Eubacterium]_rectale_group呈负相关(P<0.05)，与 Escherichia-Shigella、Blautia、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group、Bifidobacterium 和norank_f__Ruminococcaceae呈正相关(P<0.05)；Cr与Dialister呈正相关(P<0.05)；TG与Faecalibacterium 和[Eubacterium]_rectale_group呈负相关(P<0.05)，与Escherichia-Shigella、Blautia 和norank_f__Ruminococcaceae呈正相关(P<0.05)；Tch 与[Eubacterium]_rectale_group 和Dialister 呈负相关(P<0.05)，与Escherichia-Shigella、Blautia 和norank_f__Ruminococcaceae呈正相 关(P<0.05)；HDL 与norank_f__Ruminococcaceae呈负相关(P<0.05)；LDL 与[Eubacterium]_rectale_group 呈负相关(P<0.05)，与Subdoligranulum、Escherichia-Shigella、Blautia 和norank_f__Ruminococcaceae 呈正相关(P<0.05)；UI 与Bacteroides 和Faecalibacterium 和[Eubacterium]_rectale_group呈负相关(P<0.05)，与 Escherichia-Shigella、Blautia和norank_f__Ruminococcaceae呈正相关(P<0.05)。如图4B。

图4 不同环境因子在门水平(A)和属水平(B)对健康人和脊髓损伤群体群落组成的相关热图分析

3 讨论

尽管有研究描述了肠道菌群与中枢神经系统疾病之间的关联，但脊髓损伤患者在6 个月内的肠道微生物群特征尚未被描述过。本研究比较健康成人和受伤时间在6 个月内的脊髓损伤患者肠道菌群的组成，并探讨其和生化指标的关联。从CCA 结果来看，年龄对菌群分布没有显著影响。对照组的男女菌群多样性没有明显的区别，结合相似性分析来判断两组之间的差异显著大于组内的差异，可以认为年龄和性别对试验结果没有明显影响。

急性期脊髓损伤受伤原因中，40.9%为车祸，36.3%为高处坠落，这与国内外其他的关于脊髓损伤的病因调查结果相符[1-3]。患者年龄段大部分分布在39～55 岁，81.8%为男性，这些患者大部分处于劳动的黄金期，更容易遭受诸如创伤等意外伤害。大部分脊髓损伤患者存在NBD，脊髓损伤患者主要排便方式为利用甘油灌肠剂，其次为手指刺激肛门或挤压、按摩腹部。肠道菌群可能是帮助改善这一问题的潜在目标。

16S rRNA 测序观察到的OTU 覆盖率为99.9%，测序数据达到饱和，能够覆盖人类肠道菌群组群落的绝大部分物种。患者组和对照组比较，coverage 指数降低，ace 指数、sob 指数增高，表明急性脊髓损伤后，患者肠道菌群的丰度增加，但覆盖的菌群种类减少，可能与急性脊髓损伤后，机体的应激机制和代偿机制有关。β 多样性分析显示，两组间细菌群落组成存在显著性差异。说明急性期脊髓损伤患者存在肠道菌群紊乱。

本研究中，健康成人粪便微生物群的主要成分Bacteroides(拟杆菌属，即Bacteroidetes 的核心属)在脊髓损伤患者中减少。一项动物实验表明[17]，创伤性脊髓损伤可导致肠道菌群失调，可影响脊髓损伤患者的功能恢复，加重脊髓炎症和损伤。在该研究中，对胸椎损伤的雌性小鼠的粪便进行16S rRNA 测序分析，结果表明脊髓损伤后Bacteroidales(拟杆菌目)的丰度降低，与本研究的结果相似。本研究两个优势种是Firmicutes 和Bacteroidetes，也与此前研究相同[18-19]。与正常人相比，脊髓损伤患者Bacteroidetes菌群减少，Actinobacteria、Proteobacteria、Synergistetes、Saccharibacteria 和Cyanobacteria 增加，使得脊髓损伤患者的肠道菌群失调。我们推测Bacteroides 是对人体有益的菌种。Gungor等[10]的临床研究发现，脊髓损伤患者产生丁酸盐的菌落显著少于正常人群。本研究中具有短链脂肪酸产生功能的[Eubacterium]-rectale-group、Faecalibacterium、Bacteroide 和Roseburia 菌群也减少。Bacteroides 限制肠道鼠伤寒沙门氏菌扩张和粪便脱落[20]。这种效应是由微生物通过代谢产物直接产生的。推测短链脂肪酸的共生细菌改变肠道环境并帮助肠道抵抗感染。分析患者的UI 发现，大部分患者UI都高于正常参考值。由于胸段完全性脊髓损伤患者膀胱感觉异常，尿中有感染时不会出现尿频、尿急、尿痛等典型膀胱刺激症状，所以很多患者的下尿路感染无法被及时发现。因此在临床工作中要定期查尿常规，检测尿路感染情况。其次UI 含量与Bacteroides、Faecalibacterium、[Eubacterium]_rectale_group 这几种在健康人中明显富集的菌呈负相关，而与Escherichia-Shigella、Blautia、norank_f__Ruminococcaceae、Akkermansia这些在患者组中富集的菌呈正相关，说明肠道菌群的紊乱容易导致尿路感染。

综上，脊髓损伤后肠道菌群的紊乱会增加感染的发生倾向，干预患者的菌群组成可能降低感染的发生率。有待进一步研究。

脊髓损伤患者的血生化指标和健康人之间存在差异。患者组血糖水平较正常人高[21-24]。有研究表明[25]，胰岛素耐受糖尿病患者Bifidobacterium、Subdoligranulum 降低，Prevotella 升高。本研究中患者组较对照组Bifidobacterium、Subdoligranulum 增多，Prevotella-9 减少，环境因子对群落组成的相关热图分析表明，血糖水平与Bifidobacterium、Subdoligranulum 呈正相关，与Prevotella-9 呈负相关，不过只与Bifidobacterium 具有显著相关性。这提示在受伤时间较短的情况下(6个月内)，血糖水平的升高可能与胰岛素耐受关系不大，更有可能是应激的结果。6 个月内脊髓损伤患者肠道内Bifidobacterium 丰度的增加是机体为适应疾病所做的调整[26]。有研究证实[27]，运动训练如跑步机训练、主动或机器人辅助训练、有或无功能性电刺激辅助的地面训练可以改善脊髓损伤患者的高血糖。这些训练可以增加葡萄糖储存的能力，使参与葡萄糖磷酸化(己糖激酶)和氧化(柠檬酸合成酶)的酶以及葡萄糖转运蛋白增加。

脊髓损伤患者的血脂包括Tch、TG和LDL水平明显高于对照组。脊髓损伤后脂代谢紊乱，容易出现高脂血症，这与以往的研究结果相符[28]。本研究发现，Escherichia-Shigella、Blautia、norank_f__Ruminococcaceae、[Ruminococcus]_torques_group、[Ruminococcus]_gnavus_group 这些属水平的物种与TG、Tch 和LDL 呈正相关，[Eubacterium]_rectale_group、Faecalibacterium 与TG、Tch 和LDL 呈负相关。脊髓损伤后血脂变化的机制不明，有可能与运动减少及情绪和饮食改变等有关。有研究表明[29-30]，肠道菌群可以通过影响脂肪细胞因子基因的表达，影响宿主的免疫系统、内源性大麻素系统等而导致脂质代谢异常。

本研究结果表明，脊髓损伤后肠道菌群的紊乱，与血脂变化存在相关性，肠道菌群可能参与血脂的变化。这为干预脊髓损伤后代谢紊乱提供了新思路。

本研究还存在一定局限性。由于样本量有限，没有根据患者受伤时间进行分组比较，未能进一步分析脊髓损伤患者肠道菌群多样性随时间的变化规律。下一步计划进行动物实验和纵向人体研究，以确定肠道微生物和脊髓损伤NBD 之间的因果关系，明确肠道微生物在脊髓损伤发生发展中起的作用，有助于产生新的干预方法。