复方血竭微乳体外透皮吸收及抗炎活性研究

党学良 贾丽华 宋彦峰 赵 军 王庆伟

1.空军军医大学第二附属医院药剂科，陕西西安 710038；2.陕西省食品药品监督检验研究院，陕西西安 710065

复方血竭微乳由血竭、当归、川芎、肉桂4味药材组成，具有去腐生肌、促进局部血液循环和抑菌等功效，可用于治疗烧伤及其他化学物质引起的皮肤损伤[1]。本文选用复方血竭微乳中当归和川芎的主要有效成分藁本内酯作为透皮吸收的检测指标[2-3]，采用改良Franz 扩散池法进行体外透皮渗透性实验，考察不同浓度复方血竭微乳的透皮效果，利用足跖肿胀动物模型考察其抗炎作用，为复方血竭微乳的深入研究提供依据。

1 实验材料

1.1 仪器与试药

Agilent 1100液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；Franz TT-6透皮吸收仪（河南巩义予华实验仪器有限公司）；电子天平（精密度十万分之一，德国赛多利斯公司）；YSL-7A 足容积测量仪（山东医学科学院设备站）。复方血竭微乳（空军军医大学第二附属医院药剂科制备，含复方提取物药量分别为1.0%、2.5%、5.0%）；藁本内酯对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111737-201305）；乙腈（美国TEDIA 公司，色谱纯）；其余试剂均为分析纯。

1.2 实验动物

SPF 级雄性SD 大鼠64只，体重200～220 g，合格证号：37009200001779。购自空军军医大学动物实验中心[许可证号：SCXK（军）2014-007]。自由饮水摄食，室温保持在（23±2）℃。所有实验方案都获得了空军军医大学动物伦理委员会的批准。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及方法学考察

2.1.1 色谱条件 色谱柱：InertsilODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈∶水=62∶38（V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：A280 nm；柱温：25.0℃；进样量：20 μL。

2.1.2 对照品储备液的制备 精密称定藁本内酯对照品10.61 mg，置10 mL 棕色容量瓶中，用无水乙醇溶解，定容，摇匀，制备成对照品储备液，冷藏避光保存备用。

2.1.3 对照品溶液的制备 精密量取藁本内酯对照品储备液适量，用30%乙醇-生理盐水逐步稀释成10.08 μg/mL 的藁本内酯对照品溶液。

2.1.4 供试品溶液的制备 改良Franz 扩散池有效渗透面积0.785 cm2，接收池容积为15.0 mL，水浴循环温度（37±0.5）℃，接收池内300 r/min 恒速搅拌。实验时将制备好的离体大鼠皮肤平铺在接收池口上，角质层面向上，然后将供药池用夹子固定在接收池上。通过取样管将30%乙醇-生理盐水接收液注入接收池内，排净空气。体系温度恒定后，将5.0%的复方血竭微乳2 mL 加入供药池内密封。打开磁力搅拌器，定速搅拌并开始记时，24 h 后从取样管抽取接收液1.0 mL为供试品溶液。

2.1.5 专属性 分别取藁本内酯对照品溶液和供试品溶液，按“2.1.1”项下条件分别进样分析，记录色谱图，见图1。考察方法色谱系统适用性，在该条件下，藁本内酯色谱峰基线完全分离，保留时间为8.7 min（图1A），透皮接收液中的其他成分（图1B）对藁本内酯的测定无干扰。

2.1.6 标准曲线制备 精密量取藁本内酯对照品储备液适量，用30%乙醇-生理盐水逐步稀释成0.2015、1.0080、2.1020、10.0800、20.1600、30.2400、40.1500 μg/mL的藁本内酯对照品溶液。按“2.1.1”项下色谱条件进样，以藁本内酯对照品的浓度（C）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：Y=11.93C+2.85（r=0.9997）。表明藁本内酯在0.2015～40.1500 μg/mL范围内，具有良好线性关系。

图1 藁本内酯对照品及供试品溶液色谱图

2.1.7 精密度 取藁本内酯对照品储备液适量，用30%乙醇-生理盐水溶液稀释成0.2015、10.0800、40.1500 μg/mL藁本内酯对照品溶液同日内连续进样6次，测得峰面积RSD 分别为1.81%、1.49%、0.73%。

2.1.8 重复性 取同一时间点的供试品溶液，平行6份，按“2.1.1”项下色谱条件进样，测定峰面积，以藁本内酯峰面积的RSD 评价重复性。其重复性RSD≤2.0%，重复性良好。

2.1.9 稳定性 取供试品溶液，在室温下分别放置0、2、4、8、12 h，按“2.1.1”项下色谱条件分别进样测定，计算RSD 为1.11%，表明在该实验条件下，样品在12 h内比较稳定。

2.1.10 回收率 取同一批5%复方血竭微乳（藁本内酯含量为20.65 μg/mL）24 h 透皮吸收接收液9份，分成藁本内酯低、中、高浓度组，每组3份，分别加入20.16 μg/mL的藁本内酯30%乙醇-生理盐水对照品溶液0.1、1.0、3.0 mL。用30%乙醇-生理盐水定溶至5 mL 量瓶中，按“2.1.1”项下色谱条件分别进样，记录峰面积，计算得藁本内酯低、中、高浓度组的平均加样回收率分别为101.4%、100.1%、99.86%；RSD 分别为1.67%、1.22%、0.26%。见表1。

表1 样品中藁本内酯加样回收率

2.2 透皮吸收实验

2.2.1 离体大鼠皮肤的制备 大鼠适应性饲养3 d 后，腹腔注射30 %水合氯醛麻醉，脱颈处死，用剃毛器剔除腹部皮肤鼠毛，再仔细去除短毛，用手术剪剥取皮肤，除去皮下脂肪层，用生理盐水冲洗数次，滤纸吸干皮肤表面生理盐水，解剖镜下选取适当大小未损伤的皮肤备用[4-5]。

2.2.2 体外透皮吸收实验 改良Franz 扩散池有效渗透面积0.785 cm2，接收池容积为15.0 mL，水浴循环温度（37±0.5）℃，接收池内300 r/min 恒速搅拌。实验时，取SD 大鼠24只，按随机数字表法将其分为3组，分别为复方血竭微乳低剂量组（1.0%）、复方血竭微乳中剂量组（2.5%）、复方血竭微乳高剂量组（5.0%），每组8只。分别取不同组大鼠同一部位完整皮肤置于预先放有搅拌子的水平扩散池的结合部、角质层面朝上，夹紧密封。通过取样管将30%乙醇-生理盐水接收液注入接收池内，排净空气[6-7]。待体系温度恒定后，分别将复方血竭微乳低、中、高三种浓度的药物各2 mL 加入供药池内密封。磁力搅拌器定速搅拌并计时，分别在开始后2、4、6、9、12、18、24 h 从取样管抽取接收液1.0 mL，同时补加1.0 mL 已37℃预热好的新鲜接收液，排净气泡[8-10]。

采集的样品经0.22 μm 微孔滤膜过滤后进行HPLC 测定，代入标准曲线方程计算藁本内酯的浓度，并按下式计算单位面积累计透过量（Qn）。

公式中Cn为第n 个取样点测得的药物浓度（μg/mL）；V 为接收液体积（15 mL）；Ci为第i 个取样点测得的药物浓度（μg/mL）；Vi为取样体积（1.0 mL）；A 为渗透面积（0.785 cm2）。

将累积渗透量Qn对时间t 进行线性回归，所得Qn-t 方程即为Higuchi 方程，其斜率即为藁本内酯的透皮速率常数Jss[μg/（cm2·h）]。

2.3 角叉菜胶致大鼠足跖肿胀实验

SD 大鼠40只，按体重随机分为5组，即模型组、醋酸地塞米松乳膏组（阳性对照组，100 mg/kg）、复方血竭微乳高剂量组（5.0%）、复方血竭微乳中剂量组（2.5%）、复方血竭微乳低剂量组（1.0%），每组8只。实验前采用足容积测量仪测定各组正常大鼠右后足跖的体积，作为致炎前的足跖体积[11]，给药组每天分别涂抹相应的药物1次，给药后适当按摩促进吸收，模型组涂抹蒸馏水，连续3 d。于第3天给药后60 min，每只大鼠右后足注射1.0%角叉菜胶0.1 mL。分别测量致炎后1、2 h 及3 h 大鼠右后足跖容积[12-16]，计算足跖肿胀率。足跖肿胀率（%）=（肿胀后各时间点足容积－原始足容积）/原始足容积×100%

2.4 统计学方法

首先运用球形检验判断重复测量数据右后足跖容积在各时间点之间是否存在相关性，如果该检验P ＞0.05，说明重复测量数据之间实际上不存在相关性，数据符合Huynh-Feldt 条件，可按单因素方差分析方法来处理；如果P ＜0.05，说明重复测量数据之间存在相关性，不可按单因素方差分析方法处理。

2.5 实验结果

2.5.1 透皮吸收结果 低、中、高剂量组的复方血竭微乳主要活性成分藁本内酯皮肤渗透行为均符合Higuchi方程。低、中、高剂量组的复方血竭微乳主要活性成分藁本内酯在24 h 内的累积透过量分别为（153.000±6.586）、（311.200±14.520）、（454.100±23.440）μg/cm2累积渗透量Qn与时间t 呈良好线性关系，r 值均大于0.9，单位面积累积透过量在2～24 h 之间呈现明显的规律性。说明复方血竭微乳具有良好的体外释放和透皮性能，24 h 内单位面积累积透过量随药物中主要有效成分藁本内酯含量增高而增大，经皮渗透行为符合零级动力学方程。见表2、图2。

图2 三种浓度复方血竭微乳中藁本内酯大鼠皮肤的单位面积累积透过曲线

表2 藁本内酯大鼠皮肤渗透动力学参数（n=5）

2.5.2 对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀影响 整体分析发现：组间比较、时间点比较及交互作用差异均有统计学意义（P ＜0.05）。提示复方血竭微乳低、中、高剂量组能显著抑制角叉菜胶致大鼠足跖肿胀。复方血竭微乳低剂量组足跖肿胀率与模型组在致炎后1 h 比较，差异有统计学意义（P ＜0.05），其余各组分别在不同时间点足跖肿胀率与模型组比较，差异均有高度统计学意义（P ＜0.01）；致炎后1～3 h，随着时间延长，复方血竭微乳各剂量组足跖肿胀率逐渐降低，且致炎后2 h及3 h足跖肿胀率均低于致炎后1 h（P ＜0.05）；致炎后3 h 足跖肿胀率低于致炎后2 h（P ＜0.05）。

3 讨论

藁本内酯（ligustilide，又名东当归内酯）在化学结构上属于苯酞类化合物，存在于多种伞形科植物中，其中当归、川芎中的藁本内酯含量较高[17]。属于挥发油成分的藁本内酯易溶于乙醇、乙醚、乙酸乙酯、甲醇和石油醚等有机溶剂[18]，其含有不饱和苯酞结构，化学结构较不稳定。因此，为了兼顾溶解性和人体环境相似性，透皮接收液选择30%乙醇-生理盐水。

本研究采用改良Franz 扩散池，以大鼠皮肤作为体外透皮吸收皮肤，分别以满足漏槽条件的亲水和亲脂性溶液作为释放液，采用HPLC 法测定渗透液中藁本内酯浓度。高、中、低三种不同浓度的复方血竭微乳，24 h 内单位面积累积透过量随药物中主要有效成分藁本内酯含量增高而增大。在药物透皮实验过程中，为防止大鼠皮肤中含有的蛋白质和脂质等生物大分子在接收液中溶出而影响检测结果，因此在皮肤制备时要除掉多余的蛋白质和脂质物质，并在进行HPLC 法检测之前必须对接收液用滤膜进行过滤，以排除干扰，保证实验结果的准确性。

表3 复方血竭微乳对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响（）

表3 复方血竭微乳对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响（）

注：与模型组同期比较，*P ＜0.05；**P ＜0.01；与本组1 h 比较，#P ＜0.05；与本组2 h 比较，△P＜0.05

藁本内酯作为当归、川芎的主要有效成分，前期研究表明，藁本内酯具有抗动脉粥样硬化、神经保护、抗癌、抑制心肌肥大、抗炎、镇痛等广泛的药理活性[19-21]。本实验通过建立角叉菜胶致大鼠右后足跖肿胀模型来研究复方血竭微乳抗炎作用，研究表明复方血竭微乳有较好的抗炎活性。目前本课题组正在采用二甲苯致小鼠耳肿胀、醋酸扭体等模型多角度进行抗炎作用研究，为其临床应用奠定良好的研究基础。