外源激素对台闽苣苔叶片分化及再生的影响

付双彬，池梦薇，杨燕萍，姚丽娟，周庄*

(1.浙江省农业科学院亚热带作物研究所，浙江 温州 325005； 2.福建农林大学 园林学院，福建 福州 350002)

苦苣苔科植物种类繁多，全世界约有140属，2 000余种，我国有58属463种。苦苣苔科植物中许多具有极高的观赏价值和药用价值[1-2]，其中台闽苣苔(Titanotrichumoldhamii(Hemsl.) Soler.)隶属于台闽苣苔属，为苦苣苔科单属单种植物，是我国的特有种，分布范围狭窄，特产于浙江、福建和台湾，属濒危稀有种，由于其在苦苣苔科系统中的特殊位置，其研究和开发具有重要意义[2-3]。

对于濒危的重要植物，基于组织培养的繁殖和离体保存是现今较为有效的方法[4]，通过组织培养的方法，可以使用少量的植物材料，在短期内繁殖大量的优质幼苗，从而用于研究和保护。现今已有许多苦苣苔属植物组织培养的报道[5-6]，而对于台闽苣苔的组培研究不多，存在一些激素的作用以及愈伤组织、不定芽诱导分化的效率不高等现象[2-3]，因此，本文以台闽苣苔无菌苗的叶片为材料，研究了生长素2,4-D、NAA，细胞分裂素6-BA、TDZ、KT不同浓度以及组合对于台闽苣苔无菌苗叶片分化再生的影响，以期为台闽苣苔的组培繁殖提供更详尽的补充，为台闽苣苔的保护和开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

材料为台闽苣苔无菌苗，接种时将整个叶片剪下，近轴面朝上直接接在培养基上。

1.2 培养基和培养条件

以MS[6]为基本培养基，添加白砂糖30 g·L-1，琼脂7.5 g·L-1，调pH至5.8，于121 ℃灭菌30 min。外植体接种后在温度(25±2)℃、光照强度2 000 lx、光照时间16 h·d-1的条件下培养。

1.3 方法

1.3.1 NAA和6-BA不同浓度及组合对于台闽苣苔叶片分化的影响

添加NAA和6-BA浓度分别为0、0.2、0.4、0.8、1.2 mg·L-1，对两种激素进行完全随机的组合试验，每瓶接种5个叶片，重复5次。在第30天统计不定芽诱导率、愈伤诱导率和死亡率，在第120天统计记录最终生长情况。

1.3.2 NAA和TDZ不同浓度及组合对于台闽苣苔叶片分化的影响

添加TDZ浓度分别为0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 mg·L-1，NAA 0、0.1 mg·L-1，对两种激素进行完全随机的组合试验，每瓶接种5个叶片，重复5次。在第30天统计不定芽诱导率、愈伤诱导率和死亡率，在第120天统计记录最终生长情况。

1.3.3 NAA和KT不同浓度及组合对于台闽苣苔叶片分化的影响

添加KT浓度分别为0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 mg·L-1，NAA 0、0.1 mg·L-1，对两种激素进行完全随机的组合试验，每瓶接种5个叶片，重复5次。在第30天统计不定芽诱导率、愈伤诱导率和死亡率，在第120天统计记录最终生长情况。

1.3.4 2,4-D和6-BA不同浓度及组合对于台闽苣苔叶片分化的影响

添加2,4-D浓度分别为0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 mg·L-1，6-BA 0、0.1 mg·L-1，对两种激素进行完全随机的组合试验，每瓶接种5个叶片，重复5次。在第30天统计不定芽诱导率、愈伤诱导率和死亡率，在第120天统计记录最终生长情况。

1.4 数据统计与分析

不定芽和愈伤数(量)从高到低依次记为极多(大)、多(大)、少(小)；叶根完整，株高5 cm以上记为完整植株。

不定芽诱导率/%=诱导出不定芽的叶片数/叶片接种数×100；愈伤诱导率/%=诱导出愈伤的叶片数/叶片接种数×100；死亡率/%=死亡叶片数/叶片接种数×100。图表用Microsoft Excel 2016绘制，数据用平均值加减标准差表示，方差分析和多重比较(LSD)需将数据进行反正弦转换后进行，分析软件采用SPSS 22.0。

2 结果与分析

2.1 NAA和6-BA不同浓度及组合对于台闽苣苔叶片分化的影响

由表1可以看出，在所有处理中，除6-BA为1.2 mg·L-1，NAA为0.2～1.2 mg·L-1时，其它均能100%诱导产生不定芽，这些不定芽未经过愈伤组织而直接产生，并且数量极多，后期通过增殖、生根等可再生为植株[2-3]。单独来看，在不添加任何激素的培养基中，叶片能直接分化再生植株，并且会有少量根产生，但植株多而不壮，根少而不强，直接移栽不易成活，但可通过生根培养基进行再生根壮苗提高移栽存活率(图1中A、B)。在只添加NAA的培养基先期产生一定量的不定根，后期全部为愈伤组织，其中掺杂少许不定芽(图1中C、D)，并且这些愈伤在新培养基中能够增殖，转入不含激素的培养基中可分化出不定芽(图1中E)。在添加6-BA的培养基中诱导出大量不定芽(图1中F)，其中，在只添加6-BA的培养基中，一些不定芽在后期可直接再生成植株，这些植株同样多而不壮；而在同时添加NAA和6-BA的培养基中，后期又会产生少量愈伤组织，但不会有植株产生(图1中G)。

表1 NAA和6-BA不同浓度及组合对于台闽苣苔叶片分化的影响

2.2 NAA和TDZ不同浓度及组合对于台闽苣苔叶片分化的影响

如表2所示，所有的组合中都有不定芽产生，其中以TDZ 0.5、3.0 mg·L-1中不定芽诱导率最高，与1.0～2.0 mg·L-1TDZ，2.0～3.0 mg·L-1TDZ+0.1 mg·L-1NAA的处理差异不显著，并且这些产生的不定芽数量极多；在单独添加TDZ的培养基中，所有处理都能诱导出愈伤组织，其中以TDZ 3.0 mg·L-1诱导率最高，这些愈伤组织量相对NAA诱导量较少，颜色呈深绿色，表面呈颗粒状，其出现往往在产生不定芽之后(图1中H)。

A—在未添加激素的培养基中获得的再生植株；B—再生植株生根；C—在只含NAA的培养基中诱导的不定根；D—在只含NAA的培养基中诱导的愈伤；E—愈伤诱导不定芽；F—在NAA和6-BA组合下诱导的大量不定芽；G—NAA和6-BA组合诱导，后期不定芽和愈伤混合；H—TDZ诱导的愈伤；I—NAA和KT组合下诱导的不定根和不定芽；J—添加2,4-D诱导的愈伤。图1 台闽苦苣苔的分化再生

表2 NAA和TDZ不同浓度及组合对于台闽苣苔叶片分化的影响

注：同列无相同小写字母表示组间在5%水平上差异显著。表3同。

此外，在TDZ 0.1～0.5 mg·L-1时，同时添加NAA的培养基中会产生少量完整植株。

2.3 NAA和KT不同浓度及组合对于台闽苣苔叶片分化的影响

如表3所示，KT的作用与6-BA相同，主要诱导不定芽，但效果却不如6-BA，并且无论低浓度或高浓度都有一定的死亡；其中以KT 1.0 mg·L-1、KT 1.0～2.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1不定芽诱导率最高，与KT 2.0 mg·L-1，处理差异不显著，而添加有NAA的培养基中，与单独添加NAA相似，先期诱导出一定量的不定根，呈不定芽和不定根混合的状态，但无愈伤组织产生(图1中I)。

2.4 2,4-D和6-BA不同浓度组合对于台闽苣苔叶片分化的影响

在添加2,4-D的培养基中，在2,4-D为0.1和0.5 mg·L-1时，全部产生愈伤，并有少量不定芽产生，其他浓度均大部分死亡，这些愈伤组织与NAA和TDZ诱导的愈伤组织均不同，初始呈黄褐色(图1、表4)，这些愈伤组织在新培养基中能够增殖，转入不含激素的培养基中也可分化出不定芽[3]。

表3 NAA和KT不同浓度及组合对于台闽苣苔叶片分化的影响

表4 2,4-D和6-BA不同浓度及组合对于台闽苣苔叶片分化的影响

3 小结与讨论

植物生长调节剂是组培快繁的重要影响因子，不同种类、不同浓度的激素对于外植体的分化再生等都有重要的影响。在许多苦苣苔属的植物组培过程中，不定芽的诱导一般采用较低浓度的细胞分裂素，较高的浓度会抑制不定芽的伸长，并会对后续的生根造成影响[3,7]。如汤正辉等[2]、Takagi等[3]在研究台闽苣苔时，诱导不定芽分化培养基中6-BA都为0.1 mg·L-1，此外其他属内植物如半蒴苦苣苔[8]、桂林小花苣苔[9]等也采用此浓度。在本文中单独添加6-BA 0.2～0.8 mg·L-1时诱导出大量不定芽，而这些不定芽在后期可直接再生成植株，而附加一定浓度NAA同样能诱导大量的不定芽，但不能自主再生成植株。当6-BA提高到1.2 mg·L-1时，叶片开始出现死亡，此时浓度是不适宜的。

同为细胞分裂素，KT的作用效果较6-BA要强[10]，但对于台闽苣苔叶片外植体的诱导效果并不如6-BA，在较低浓度下才有比较好的效果，较高时外植体枯黄死亡率较高。同样的，在非洲紫罗兰的组培中，6-BA与NAA的搭配优于KT与NAA的搭配[11]，此外其他研究者对比研究了在NAA浓度固定的前提下，与6-BA、KT、ZT和2,4-D 4种不同激素配合的诱导效果，结果均表明6-BA的诱导率最高[12]。

NAA、2,4-D在许多植物的组培中对愈伤组织的诱导起重要作用[10]，如苦苣苔属植物大岩桐愈伤组织的形成最佳激素组合为2,4-D 2.0 mg·L-1+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1[13]，而在台闽苣苔中添加0.1 mg·L-12,4-D即可诱导出大量愈伤组织，但2,4-D的量要严格控制，过高可能会导致外植体死亡，并且对不定根的诱导是不利的[14]。NAA有诱导不定根的效力，这在单独添加NAA和KT、NAA的组合中体现较明显，在单独添加NAA 0.2～1.2 mg·L-1时，先期产生一定量不定根，后期叶片外植体全部诱导出愈伤组织，而且质量也较2,4-D的高。

TDZ是一种效果很强的细胞分裂素，被认为具有生长素和分裂素双重作用[15]，在许多植物的愈伤诱导过程中发挥了关键作用，在褐纹报春苣苔的组培研究中，添加2.0 mg·L-1TDZ+0.1 mg·L-1NAA适于愈伤诱导[16]；文弢等[17]在大苞短毛唇柱苣苔的不定芽诱导时，发现TDZ起主要作用，当浓度为0.5 mg·L-1有利于诱导率和不定芽数量的提高。在此文中TDZ单独添加主要诱导愈伤组织的产生，同时附带大量不定芽，往往愈伤组织出现在后；而在TDZ低浓度时添加NAA，会减少愈伤诱导效果，而向不定芽和再生植株的方向转变。

台闽苣苔叶片外植体不经切割，在不含激素或含0.2～0.8 mg·L-16-BA的MS上能直接再生成植株，虽然这些植株移栽成活率较低，但植株的完整性表明这些材料在后续研究中的潜在价值以及继续研究的价值；此外，TDZ、NAA、2,4-D对于愈伤诱导的高质量、高效率为台闽苣苔后续的保护和开发奠定了良好的基础。