蛋鸡热应激与细胞凋亡相关基因表达

王德前，陆建强，董捷，黄敏婕

(1.浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所， 浙江 杭州 310021； 2.建德市建珂养殖有限公司，浙江 杭州 311612)

浙江省蛋鸡养殖规模化、集约化程度不断提高，养殖场多采用高密度饲养模式与高强度生产方式，加上夏季高温高湿等极端天气频发，蛋鸡热应激防控已成为困扰蛋鸡养殖场的重要难题。蛋鸡适宜饲养温度为15 ℃～25 ℃，超过该范围容易引发蛋鸡应激反应，导致机体糖、蛋白质、脂肪和矿物质等营养物质代谢紊乱，轻则引起采食量、产蛋率和鸡蛋品质下降，重则直接导致蛋鸡死亡，严重影响我省夏季蛋鸡安全生产。

发生热应激反应时，机体细胞大量表达热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)。HSPs作为一类多肽类蛋白，广泛存在于原核和真核生物细胞内，对维持细胞结构和功能具有重要作用。HSP70是热休克蛋白家族中最具代表性、分布最广的蛋白成员，具有分子伴侣、协同免疫、维持细胞内环境稳定等功能[1]。HSP70表达水平与温度变化紧密相关，对生物的热耐受性有着重要影响。正常情况下机体中HSP70低水平表达，热应激条件下HSP70大量表达，行使分子伴侣功能，通过协助维持蛋白结构、修复变性蛋白、阻止细胞内变性蛋白蓄积等方式保护细胞免受损伤[2]。此外，HSP70还通过介入细胞凋亡信号转导通路调节相关基因表达，直接参与细胞凋亡过程[3]。热应激可促进HSP70进入H9C2心肌细胞核。HSP70表达抑制后，HSP70蛋白入核显著降低，促进细胞凋亡[4]。采用RNA干涉调低人胃癌细胞HSP70表达水平，抑制肿瘤细胞生长，促进细胞凋亡发生[5]。HSP70过表达抑制具有促进细胞死亡功能的基质金属蛋白酶活性，保护细胞免受热应激损伤[6]。

本研究采用qRT-PCR方法监测不同温度条件下蛋鸡心脏和肝脏组织中HSP70表达，以及肝脏组织中细胞色素C氧化酶(CCO)、肿瘤坏死因子凋亡诱导因子配体(TRAIL)、应激活化蛋白激酶(SAPK)和蛋白激酶(PKB)等细胞凋亡信号通道关键基因转录水平差异，探讨HSP70对蛋鸡热耐受性与细胞凋亡的影响，进一步明确蛋鸡热应激发生机理，便于精准采取有效措施进行蛋鸡热应激防控。

1 材料与方法

1.1 处理设计

90只170日龄伊莎蛋鸡进行2周适应性饲养，平均分为对照组(25 ℃常温饲养)、实验组Ⅰ(30 ℃热应激处理)和实验组Ⅱ(35 ℃热应激处理)，每组30只(每组3个重复，每个重复10只)，试验期1周。无菌采集心脏、肝脏组织样本，液氮保存备用。

1.2 样品检测

1.2.1 RNA提取与反转录

取2～3 g组织样本于液氮中研磨至粉末状，称取200 mg粉末，使用Trizol试剂盒提取总RNA，1%甲醛变性琼脂糖电泳检测提取的总RNA质量，紫外分光光度计测定总RNA含量，稀释至100 ng·μL-1，使用反转录试剂盒反转录成cDNA，-20 ℃保存。

1.2.2 引物设计

参照禽类HSP70、CCO、TRAIL、SAPK和PKB基因序列，Primer 6.0设计荧光定量PCR引物，内参基因采用鸡β-actin，引物由Invitrogen(上海)贸易有限公司合成。引物序列见表1。

表1 各基因的引物序列

1.2.3 反应体系与程序

qRT-PCR反应体系为20 μL：2×SYRB Premix Ex Taq 10.0 μL，上、下游引物各1 μL， cDNA 2.0 μL、ddH2O 6.0 μL。反应程序：95 ℃预变性35 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火和延伸35 s，35个循环。溶解曲线：60 ℃升温至95 ℃ 15 s，60 ℃保温1 min，95 ℃保温20 s。

1.3 统计分析

利用2-ΔΔCt法对荧光定量PCR数据进行统计，运用SPSS 13.0软件进行数据分析，采用独立样本T检验进行不同处理组间比较。

2 结果与分析

2.1 蛋鸡心脏和肝脏组织HSP70表达情况

蛋鸡心脏和肝脏组织HSP70表达量均随温度升高而逐步增加。实验组Ⅱ蛋鸡心脏组织HSP70表达量最高(P<0.01)，25 ℃常温对照组和30 ℃热应激处理间HSP70表达差异不显著。各处理组蛋鸡肝脏组织HSP70相对表达量差异显著，30 ℃热应激处理组显著高于25 ℃常温对照组，35 ℃热应激处理组极显著高于25 ℃常温对照组和30 ℃热应激处理组(图1)。

*—差异显著(P<0.05)；**—差异极显著(P<0.01)。图2同。图1 热应激对蛋鸡心脏和肝脏HSP70 mRNA转录水平影响

2.2 蛋鸡肝脏组织细胞凋亡相关基因表达情况

与正常对照组相比，蛋鸡30 ℃热应激处理后的肝脏组织细胞色素C氧化酶(CCO)、肿瘤坏死因子凋亡诱导因子配体(TRAIL)和应激活化蛋白激酶(SAPK)基因相对表达量变化不显著，35 ℃热应激处理使肝脏组织CCO、TRAIL、SAPK表达量极显著降低；蛋白激酶(PKB)表达量极显著升高。35 ℃热应激处理后，蛋鸡肝脏PKB表达极显著高于30 ℃热应激处理组和25 ℃正常对照组(图2)。

图2 蛋鸡肝脏细胞凋亡相关基因转录水平

3 讨论

HSP70广泛参与各种维持和保护细胞功能，增强机体对应激的耐受能力，提高细胞存活率，是一种重要的细胞质分子伴侣保护蛋白[7]。急性和慢性热应激均能上调蛋鸡心脏和肝脏组织HSP70 mRNA表达水平[8]，热应激能提升鸡肝脏基因表达谱中HSP70基因表达丰度[9]，急性噪声应激导致肉鸭心脏和肝脏HSP70、HSP90表达量升高，缓解热应激引起的细胞损害[2]。本研究中，蛋鸡心脏和肝脏组织热休克蛋白的表达情况同上述研究结果基本一致。心脏和肝脏组织HSP70 mRNA相对表达量随着温度升高而增加，热休克蛋白表达量和温度呈一定程度正相关。在正常饲养条件下，肝脏HSP70 mRNA表达量是心脏的3.39倍，热应激后2种组织HSP70 mRNA表达量相差2.87倍。HSP70高表达有利于蛋白质维持正常构象，保持细胞功能，提高对外界不良刺激的抵抗能力[9]。

细胞凋亡受到促凋亡信号通路与抗凋亡信号通路的双重调控。细胞促凋亡信号通路分为由线粒体介导的内源性细胞凋亡信号通路和由死亡受体介导的外源细胞凋亡信号通路[10]。细胞色素C氧化酶基因、肿瘤坏死因子凋亡诱导因子配体分别为线粒体介导与死亡受体介导的促凋亡信号通路关键基因，应激活化蛋白激酶基因在细胞促凋亡信号通路上游基因，这3个基因的高表达都有促进细胞凋亡的功能。本研究中，随着温度升高，肝脏细胞中HSP70高表达，导致CCO、TRAIL和SAPK基因表达水平显著下降，抑制细胞凋亡。过量HSP70与Bax结合，导致迁移至线粒体的Bax减少，抑制了细胞色素C的释放，引起下游半胱氨酸蛋白酶(Caspase)失活，通过线粒体介导的内源性细胞凋亡信号通路抑制细胞凋亡[11]。HSP70蛋白过表达，与TRAIL竞争性结合成TRAIL-R1，导致死亡信号复合体解离，抑制Caspase-8活性，通过死亡受体介导的外源细胞凋亡信号通路抑制细胞凋亡[12]。HSP70还通过抑制应激活化蛋白激酶表达，在细胞促凋亡信号通路上游发挥作用抑制细胞凋亡[13]。HSP70作为多种激酶分子伴侣，与PKB及伴侣分子Cdc37形成复合体，活化PKB功能，通过抑制细胞抗凋亡信号通路保护细胞免受损伤[14]。综上所述，高温环境能引起蛋鸡心脏和肝脏组织HSP70过量表达，影响CCO、TRAIL等细胞凋亡信号通路关键基因的表达水平，调节细胞凋亡过程，对蛋鸡机体细胞功能有重要作用，严重影响蛋鸡生产性能。保持适宜饲养温度对维持蛋鸡组织细胞结构和功能，保持高产性能具有重要的作用，为在生产中采取精准措施防控热应激、保障动物福利提供了基础数据。