外源水杨酸缓解镉对番茄毒害作用的研究

2019-12-23王小红郭军康贾红磊李艳萍

农业环境科学学报 2019年12期

王小红，郭军康，贾红磊，李艳萍，吕欣，任倩

（陕西科技大学环境科学与工程学院，西安710021）

随着工业的发展，“三废”排放量增加，历史上污灌、污泥的肥料化施用使农田土壤中的Cd 浓度逐年增加。Cd 是生物非必需元素，高浓度的Cd 会对植物产生严重的毒害作用，干扰植物光合和呼吸作用，影响植物对营养元素的吸收与代谢，引起膜脂过氧化并损坏抗氧化系统[1]。Cd 易被作物根系吸收，并转移到地上部甚至积累到作物果实中，通过食物链对人类的健康构成威胁。番茄是一种重要的果蔬食物，在我国种植面积约为133.3 万hm2[2]，随着土壤重金属污染风险加剧，菜地土壤污染修复与蔬菜安全生产引起全社会的高度重视。水杨酸（SA）是一种小分子酚类物质，也是一种调节植物响应外界胁迫的重要激素[3]。最新研究表明，SA 能够缓解重金属对植物的毒害作用，增强植物的抗性。Lu 等[4]研究表明外源喷施50 μmol·L-1的SA 可减轻10 μmol·L-1CdCl2胁迫下浮萍的膜脂过氧化。杨建霞等[5]研究表明水杨酸可以缓解重金属胁迫对紫花苜蓿造成的氧化损伤，提高紫花苜蓿叶片中POD、SOD 和CAT 的活性。然而，水杨酸缓解番茄重金属Cd 毒害，调控番茄Cd 吸收与累积机制尚不明确。因此本研究通过开展相关试验，研究不同Cd污染程度下外源水杨酸对番茄生长和抗氧化系统酶活性影响，及不同浓度水杨酸对番茄重金属Cd吸收与累积的调控。研究不同污染浓度下，水杨酸施用量对作物生长，重金属毒害缓解和重金属吸收、累积调控，为重金属超标菜地蔬菜安全生产提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本试验采用的番茄（Solanum lycopersicumL.）品种为石红三号，购于新疆石河子蔬菜研究所番茄研究开发中心。水杨酸（SA）购买于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验设计

挑选饱满的番茄种子若干，用15%的次氯酸钠溶液浸泡15 min，去离子水冲洗3 次后播种于蛭石盘中，置于人工植物培养室。人工植物培养室的温度控制在昼26 ℃/夜20 ℃，昼夜时间为16 h/8 h，相对湿度为60%。待幼苗长至“两叶一心”时，将其移栽到水培箱中，先用1/2 浓度的霍格兰营养液（pH=6.5）培养2周，再用霍格兰全培养液（pH=6.5）培养2周[6]，然后选取长势良好且一致的幼苗进行试验处理。共设置20个处理组，分别为：CK、C1、C1+SA25、C1+SA50、C1+SA100、C1+SA200、C3、C3+SA25、C3+SA50、C3+SA100、C3+SA200、C5、C5+SA25、C5+SA50、C5+SA100、C5+SA200、SA25、SA50、SA100、SA200。CK 代表空白对照；C1、C3、C5 分别代表1、3、5 mg·L-1Cd 处理；数字25、50、100、200分别代表用浓度为25、50、100、200 μmol·L-1的SA 预处理。其中SA（25、50、100、200 μmol·L-1）在Cd处理3 d前于暗处喷洒于番茄叶片，Cd以3CdSO4·8H2O形式加入营养液中，最终培养液中Cd浓度为1、3、5 mg·L-1，每组处理设置6个平行。

1.3 番茄生物量、株高及根长的测定

在加Cd处理7 d后收样，收样前量取各个番茄苗的株高和根长，并分开收集番茄的地上、地下部分。番茄根部在5.0 mmol·L-1的乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）溶液中浸泡15 min，去除根表面附着的Cd，然后用去离子水冲洗数次[7]，地上部分也用去离子水冲洗数次，用吸水纸将表面水分吸干，然后置于烘箱中于105 ℃杀青、烘干。待植物样品烘干至恒质量后，记录下地上、地下部干质量，然后保存于干燥处用于Cd含量测定。

1.4 番茄中Cd积累量的测定

准确称取0.2 g 烘干后的植物样品于消解管内，加入10 mL HNO3浸泡12 h，然后用电热消解仪（Digi-Block ED54，LabTech）加热消解。消解步骤为：80 ℃加热1.5 h，120 ℃加热1.5 h，150 ℃加热3 h[8]。然后在175 ℃下蒸发硝酸剩余至1 mL左右停止加热，冷却后将其转移至25 mL 容量瓶并定容。定容后用0.45 μm的滤膜过滤，然后用火焰炉原子吸收光谱仪（AAS；ZEEnit700P/650P，Analytik-Jena，Germany）测定Cd 浓度，每个样品重复3次。

1.5 番茄根系活性氧的荧光标记

由于100 μmol·L-1SA 预处理下对番茄生长的促进作用以及Cd 积累减少作用最显著，所以选取SA 处理浓度为100 μmol·L-1番茄根系活性氧的荧光标记方法，参考Jia 等[9]的研究，室温下剪取番茄幼苗主根距根尖1 cm 切段，在黑暗中用20 μmol·L-1的活性氧荧光探针H2DCF-DA 浸泡60 min[荧光探针加在10 mmol·L-1的Tris-HCl 缓冲液（pH=7.4）中]，然后用10 mmol·L-1的Tris-HCl缓冲液漂洗2次，每次15 min，漂洗后立即在激光共聚焦显微镜上进行整根观察（激发光495 nm，发射光515 nm）。每个处理3个平行。

1.6 番茄丙二醛含量和抗氧化酶活性的测定

酶液提取方法参考郭军康的研究[10]，收样时用去离子水将根和叶冲洗3 遍去掉表面附着物，吸干水分快速称量鲜质量。然后用液氮速冻，保存于-80 ℃冰箱。测定时，将-80 ℃保存的番茄叶片或根系组织放入预冷研钵中，加入1∶10（g∶mL）的提取缓冲液[50 mmol·L-1磷酸钾缓冲液（pH=7.0）包含1 mmol·L-1EDTA，1% PVP-30]研磨提取。匀浆后离心20 min（4 ℃，10 000 r·min-1），收集上清液用于测定酶活性。

过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GR）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）的酶活性采用试剂盒检测（索莱宝）；超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用氮蓝四唑（Nitro Blue Tetrazolium chloride，NBT）比色法[11]；过氧化物酶（POD）活性测定采用愈创木酚法[12]。丙二醛含量的测定采用硫代巴比妥酸法[13]。

1.7 数据分析

利用Excel 2003 分析数据，Origin 8.5 作图，使用软件SPSS 17.0（One-way ANOVA）进行统计分析，P＜0.05为差异显著。

图1 不同处理下番茄幼苗的根长Figure 1 Root length of tomato seedlings under different treatments

2 结果与分析

2.1 SA对Cd胁迫下番茄株高、根长和生物量的影响

由图1～图3 可知，Cd 浓度为1 mg·L-1时，番茄的生长几乎没有受到影响，株高、根长、生物量和CK 几乎没有区别。Cd浓度为3 mg·L-1时，番茄的生长已经受到了抑制作用，相比于CK，株高下降了8.3%，根长减少了4.6%，根、茎和叶的干质量分别减少了22.1%、16.9%和13.2%（P＜0.05）。Cd 浓度为5 mg·L-1时，对番茄的生长产生了显著的抑制作用，相比于CK，株高下降了11.7%，根长减少了14.5%，根、茎和叶的干质量分别减少了37.5%、24.3%和21.2%。单独SA处理，浓度在25、50 μmol·L-1时对番茄生长的促进作用不明显，而浓度在100 μmol·L-1时对番茄生长有显著的促进作用，相比于CK，株高增长了10%，根长增加了6.4%，根、茎和叶的干质量分别增加了17.2%、5.4%和7.6%。当SA 浓度为200 μmol·L-1时却对番茄生长产生了抑制，株高、根长和生物量都有不同程度的下降。另外，100 μmol·L-1的SA 预处理缓解番茄Cd 胁迫的作用也最为显著，在高浓度Cd 胁迫（5 mg·L-1）下，相比于单独Cd 处理，C5+SA100 处理组的株高增加了10.2%，根长增加了14.2%，根、茎和叶的干质量分别增加了40%、27.2%和24%。

2.2 SA对Cd胁迫下番茄中Cd积累量的影响

图2 不同处理下番茄幼苗的株高Figure 2 Plant height of tomato seedlings under different treatments

图3 不同处理下番茄幼苗的生物量Figure 3 Biomass of tomato seedlings under different treatments

由图4 可知，Cd 处理浓度为1 mg·L-1时，番茄根和叶中分别积累了663.5 mg·kg-1和44.4 mg·kg-1的Cd，SA 预处理浓度为25、50、100 μmol·L-1和200 μmol·L-1时，番茄根中Cd 积累量分别下降了1.8%、24.6%、50.5%和4.1%，叶中Cd 积累量分别下降了40.2%、37.9%、50.8%和44.9%；Cd 处理浓度为3 mg·L-1时，番茄根和叶中分别积累了1 337.9 mg·kg-1和69.9 mg·kg-1的Cd，SA 预处理浓度为25、50、100 μmol·L-1和200 μmol·L-1时，番茄根中Cd 积累量分别下降了38.1%、39.2%、52.8%和11%，叶中Cd 积累量分别下降了13.7%、11.5%、24.4%和16.1%；Cd处理浓度为5 mg·L-1时，番茄根和叶中分别积累了1 843.3 mg·kg-1和211.3 mg·kg-1的Cd，SA 预处理浓度为25、50、100 μmol·L-1和200 μmol·L-1时，番茄根中Cd 积累量分别下降了73.3%、71.2%、75.5%和42.9%，叶中Cd积累量分别下降了34.4%、46.5%、58.3%和38.9%。

2.3 SA和Cd胁迫对番茄根尖活性氧的影响

图5A 为不同处理下番茄根尖的活性氧荧光照片，图5B 是通过ImageJ 软件对荧光强度的相对定量分析图。可以看出，Cd 处理浓度为1、3、5 mg·L-1时，番茄根尖的活性氧荧光亮度都强于CK，3 mg·L-1和5 mg·L-1的Cd 处理下，荧光亮度强于1 mg·L-1的Cd 处理。SA100 单独处理后，番茄根尖活性氧的荧光强度高于CK。C1+SA100 处理组的荧光亮度强于C1 处理组，C3+SA100 和C5+SA100 的荧光强度分别弱于C3和C5。

图5 不同处理下番茄根系活性氧的荧光标记Figure 5 Fluorescent labeling of active oxygen in tomato roots under different treatments

2.4 SA 对Cd胁迫下番茄中5个抗氧化酶活性和MDA含量的影响

由图6和图7可知，在1 mg·L-1Cd处理下，番茄根和叶中的5种抗氧化酶（CAT、SOD、POD、APX、GR）活性都显著升高。在3 mg·L-1Cd 处理下，根和叶中POD、APX 的活性都显著降低，根中CAT 活性仍然显著升高。在5 mg·L-1Cd 处理下，番茄根和叶中的CAT、SOD、POD、APX、GR 活性都显著降低，远小于CK 对照组。总的来说，这5 种抗氧化酶的变化趋势为：低浓度Cd 胁迫显著诱导了其活性升高，随着Cd处理浓度的增加，5种酶的活性呈现下降趋势。

单独100 μmol·L-1SA 预处理后，番茄根和叶中SOD、POD、APX、GR 的活性都显著升高，叶中CAT 活性也升高，但根中CAT 的活性却显著降低。SA 预处理可以显著提高不同浓度Cd 胁迫下抗氧化酶的活性，SA+Cd 处理组的SOD、POD、APX 和GR 活性都显著高于单独Cd处理组。

另外，在1、3、5 mg·L-1Cd 处理下，番茄叶中的MDA 含量分别增加了51.3%、62.2%、73.1%，根中分别增加了55.4%、68.8%、83.3%。SA 预处理后，Cd 胁迫下，番茄叶中的MDA 含量减少了24.6%～40.8%，根中减少了30.9%～44.4%。

图6 不同处理下番茄根中抗氧化酶活性和丙二醛含量Figure 6 Antioxidant enzyme activity and malondialdehyde content in tomato root under different treatments

3 讨论

3.1 SA对Cd胁迫下番茄株高、根长和生物量的影响

SA 作为一种植物激素，适量使用可以促进植物的生长发育，但过量后反而会对植物造成伤害。Kováčik 等[14]认为不同植物适应SA 的量是不同的，适量浓度的SA 可以诱导植物产生系统获得性抗性，增强植物抵御外界胁迫的能力，从而促进植物的生长，但过量的SA 会使植物发生超敏反应，引起细胞程序性死亡，进而抑制植物生长。Poór等[15]认为高浓度SA（≥200 μmol·L-1）处理会使H2O2过量积累，产生重度氧化胁迫，从而抑制植物生长。本研究结果得出，100 μmol·L-1SA对番茄的生长促进作用最为明显，而200 μmol·L-1SA 会抑制其生长，这说明100 μmol·L-1的SA 处理可以激活番茄的系统抗性，促进番茄的生长。Zhao[16]研究发现，低浓度的Cd 对番茄幼苗生长几乎没有抑制作用，然而高浓度Cd胁迫下，细胞内积累的较多的Cd 扰乱了细胞的代谢生理平衡，使番茄幼苗的生长受到了抑制。本研究也得到了相似的结果，这说明Cd 对番茄的毒害作用是呈剂量效应的。Drazic 等[17]用10 μmol·L-1的SA 预处理紫花苜蓿种子，显著降低了MDA 含量，缓解了Cd 对根和茎生长的抑制作用。Ahmad 等[18]研究表明用1.0 mmol·L-1SA 预处理可以显著提高芥菜中抗氧化酶的活性，从而缓解Cd 对芥菜生长的抑制。本研究得出，100 μmol·L-1SA 预处理可显著缓解高浓度Cd（5 mg·L-1）胁迫对番茄生长的抑制，这可能是因为SA 提高了Cd胁迫下抗氧化酶的活性，减少了MDA 的积累，从而减弱了Cd对番茄的毒害作用。

图7 不同处理下番茄叶中抗氧化酶活性和丙二醛含量Figure 7 Antioxidant enzyme activity and malondialdehyde content in tomato leaf under different treatments

3.2 SA对Cd胁迫下番茄中Cd积累量的影响

已有研究证明大部分植物地上部分对Cd较为敏感，因此它们主要将Cd积累在根中，向地上部转移的较少[19]。在本试验中，番茄根部积累了89.7%～93.7%的Cd，只有较少的Cd 运输到地上部，说明番茄本身对Cd 胁迫有一定的抗性。Liu 等[20]研究指出SA 可以调节离子的跨膜运输，限制重金属的吸收与运输。Gu等[21]证明SA预处理显著降低了睡莲根、茎、叶中的Cd积累。Raza 等[22]表明SA 处理促进了Ca离子内流，占用了离子通道，从而抑制了Cd 离子的吸收。本试验结果证明了外源SA 预处理可以显著降低番茄地上、地下组织中的Cd 积累，并且在高浓度Cd 胁迫下作用更加显著，这可能是SA 通过调控Cd 离子的吸收与排出机制，使进入到细胞内的Cd减少。

3.3 SA和Cd胁迫对番茄根尖活性氧含量的影响

植物在遇到外界环境胁迫时，细胞内会产生大量的活性氧，从而引起细胞氧化，对植物细胞造成危害，但适量的活性氧能够诱导植物产生系统抗性，对植物的生长具有积极作用[23]。Lee 等[24]表明SA 处理可以诱导拟南芥根中活性氧的积累，从而提高抗氧化酶的活性来缓解盐胁迫。Singh 等[25]表明SA 可以快速诱导植物组织中活性氧的积累，使植物获得系统抗性，在抵御外界胁迫方面起到重要作用。在本研究的结果中，外源喷施SA 后，番茄根尖的活性氧含量增加，活性氧作为第二信使分子可以激活植物抗氧化系统，进而提高抗氧化酶活性。本研究也得出SA预处理可以显著提高SOD、POD、APX、GR这4种抗氧化酶的活性，因此可以证明SA 诱导的活性氧对植物抵御外界胁迫起到了积极作用。已有研究指出，重金属Cd、Cu、Pb 等都会导致植物根系活性氧的过多积累，从而使植物细胞膜脂过氧化，对植物根系产生严重毒害作用[26]。在本试验结果中，活性氧的积累随着Cd 处理浓度的增加而增加，同时番茄的根长、生物量也受到严重抑制，番茄中几种抗氧化酶活性也显著降低，说明高浓度Cd胁迫下诱导的活性氧对番茄产生了严重的毒害作用。

3.4 SA对Cd胁迫下番茄中MDA和抗氧化系统的影响

MDA 是膜脂过氧化产物，它的增加表明植物细胞受到了氧化伤害，本研究结果显示，单独Cd 处理后，番茄根和叶中MDA 含量显著上升，并且Cd 处理浓度越高，番茄中MDA 含量越多，说明Cd 胁迫对番茄根和叶细胞产生了严重的氧化损伤。而在SA预处理后，不同浓度Cd 胁迫下，MDA 含量均显著低于单独Cd 处理。Dong 等[27]研究指出SA 预处理诱导的活性氧作为第二信使启动了抗氧化系统，从而降低了盐胁迫下棉花中的MDA 含量；Ali等[28]指出外源使用SA提高了Cd胁迫下油菜中抗氧化酶的活性从而清除了过量的MDA。这些结果表明，SA 可以通过诱导活性氧产生来激活植物体内抗氧化酶系统，进而降低Cd胁迫对植物细胞膜的氧化伤害。

过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和谷胱甘肽还原酶（GR）是植物活性氧代谢中重要的抗氧化酶，它们使植物细胞免于遭受H2O2的毒害。超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）是机体内O2-的天然消除剂，在生物体的自我保护系统中起着极为重要的作用[29]。本研究结果得出，100 μmol·L-1SA单独处理后，SOD、POD、APX、GR这4种抗氧化酶活性都显著提高，而CAT 的活性却降低。Chen等[30]指出SA可以与CAT结合，抑制CAT的活性，从而导致H2O2的积累，然后H2O2作为信使分子，激活植物的抗氧化系统，提高抗氧化酶SOD、POD、APX、GR 等的活性，进而形成自我防御反应。Sihag 等[31]研究表明，用外源SA 处理高粱幼苗，可显著提高幼苗内SOD、POD、APX、GR 等的活性，从而提高了高粱幼苗对铬胁迫的抗性。这些结果表明SA可以通过激活植物抗氧化系统来抵御外界胁迫造成的氧化伤害。

Cd 胁迫会使植物中活性氧含量增加，这可能会激活植物的抗氧化防御系统，有研究表明Cd 胁迫诱导的大量活性氧可以诱导抗氧化酶SOD、CAT、POD的活性升高，且活性随着Cd 浓度的增加而增加[32]。章秀福等[33]研究表明，抗氧化酶对植物的保护具有一定限度，低浓度Cd胁迫可以提高抗氧化酶的活性，但在高浓度Cd 胁迫下，抗氧化酶的活性显著降低。覃勇荣等[34]表明，在低浓度的Cd 胁迫下，任豆幼苗的SOD、POD 和CAT 活性均有不同程度的升高，然而在高浓度的Cd 胁迫下，SOD、POD 和CAT 活性则逐渐降低。本研究结果与此相似，低浓度的Cd 胁迫可以诱导番茄组织中5 种抗氧化酶（SOD、CAT、POD、APX、GR）活性的提高，但是随着Cd 浓度的增加，5 种抗氧化酶的活性呈下降趋势，在高浓度Cd（5 mg·L-1）胁迫下，这5 种抗氧化酶的活性显著低于CK 对照组。这些结果说明低浓度的Cd 可以诱导植株产生氧化抗性，但在高浓度Cd胁迫下，植物的抗氧化系统可能被破坏，无法抵御氧化胁迫，这也就是为什么高浓度Cd胁迫下，番茄组织中的MDA 含量显著高于低浓度Cd胁迫。

已有研究指出外源SA可以缓解重金属对植物的氧化胁迫，Zhang 等[35]研究认为SA 通过提高水稻幼苗的SOD、POD 和GR 活性来缓解Cd 造成的氧化胁迫。Bai 等[36]研究表明SA 处理能够提高Cu 胁迫下SOD、CAT、GR 的活性，缓解Cu 对小麦根系的氧化伤害。本试验结果得出，SA 预处理可以显著提高Cd 胁迫下SOD、POD、APX 和GR 的活性，并减少MDA 的积累。结合前人研究以及本研究结果都证明了SA可以增强植物抵御重金属毒害的能力，SA 可能通过提前刺激植株产生系统抗性，激活植物体内的抗氧化保护酶，从而缓解重金属的毒害作用。