人CD147胞内结构域蛋白的表达与纯化

吴 东，南 刚，李佳悦，刘芬玲，崔洪勇

CD147是Ⅰ型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族。CD147在正常组织及胚胎组织中低表达，在上皮来源的癌组织中高表达，与肿瘤发生发展密切相关，是一个癌特异性的、新型广谱的肿瘤标志物[1]。诱导肿瘤细胞以及成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是CD147最主要的功能之一[2]，体内外实验表明，CD147能够促进肿瘤的侵袭和转移[3]。研究证实，CD147能够调节肿瘤细胞间充质样运动形式和阿米巴样运动形式的转换[4-5]，调控肿瘤细胞的代谢和自噬[6-7]。此外，多发性骨髓瘤细胞表面的CD147能够作为骨髓内皮细胞分泌的亲环素(cyclophilin A，CyPA)的受体促进多发性骨髓瘤细胞增殖和归巢[8]，胰腺癌细胞表达的CD147与CyPA结合能够促进胰腺癌进展[9]，但是CD147诱导MMPs分泌、调控肿瘤侵袭转移的分子机制尚未阐明，尤其是CD147胞内结构域(CD147 intracellular domain，CD147ICD)的生物学功能和分子机制鲜见报道。

CD147分子全长269个氨基酸，N端21个氨基酸为信号肽，参与CD147分子的生物合成和转运，信号肽之后的185个氨基酸为胞外段，接下来的24个氨基酸为跨膜区，胞内结构域由C端39个氨基酸构成。CD147胞外段包含2个Ig样结构域，N端为C2结构域(2～101位氨基酸)，C端为I样结构域(107～205位氨基酸)，2个Ig样结构域之间由5个氨基酸连接。CD147跨膜区序列在人、小鼠和鸡之间完全保守，提示跨膜区有重要生理功能。CD147ICD在种属之间也高度保守，提示胞内结构域可能参与介导细胞外信号向细胞内的传递[10]。本实验室先后解析了CD147胞外段2.0Å晶体结构[11]和CD147胞外段与CyPA相互作用的液相结构[12]，但CD147ICD的互作分子及蛋白质结构知之甚少。本研究通过构建CD147ICD重组质粒并制备纯化CD147ICD，为CD147ICD互作分子的鉴定和蛋白质结构解析提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料 Premix PrimeSTAR DNA聚合酶、DNA限制性内切酶、连接酶购自宝日医生物技术(北京)有限公司；DH5α、Origami B(DE3)感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司；二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)、异丙基硫代-β-d-半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)购自美国Sigma公司；蛋白酶抑制剂购自瑞士罗氏公司；凝血酶购自Solarbio公司；Ni-Sepharose FF预装柱购自美国GE公司；引物由华大基因合成；3 KD超滤管、10 KD超滤管购自美国Millipore公司；BCA蛋白质定量试剂盒购自美国Pierce公司；其他试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 重组质粒的构建和鉴定 以人cDNA为模板，PCR扩增CD147ICD片段(上游引物：5′-TGGGTACCATGAAGCGCCGGAAGCCCGAG-3′，下游引物：5′-CAGATATCTCAGGAAGAGTTCCTCTGGC-3′；反应条件：98 ℃ 10 s，68 ℃ 10 s，30个循环),经KpnⅠ/EcoRⅤ双酶切后连接入pET-32a(+)质粒，将连接混合物转化DH5α感受态细胞，挑取克隆后进行测序分析。取10 ng重组质粒pET-32a(+)/CD147ICD转化Origami B(DE3)感受态细胞，挑取克隆经酶切鉴定后冻存保种。

1.3 蛋白的表达和纯化 接种5 μL pET-32a(+)/CD147ICD/Origami B菌液至5 mL Amp+/Kan+/Tet+LB培养基中，37 ℃振荡培养过夜。转接5 mL培养过夜的pET-32a(+)/CD147ICD/Origami B菌液至500 mL Amp+/Kan+/Tet+LB培养基中，37 ℃振荡培养6～7 h后(OD600=0.6)，加入500 μL 1 mol/L IPTG，37 ℃振荡培养2～5 h。6 000 r/min离心6 min 收集菌体，Ni-NTA A液重悬洗涤1次，-80 ℃冻存。室温融解菌泥，加入8 mL含蛋白酶抑制剂的Ni-NTA A液，振荡重悬。冰浴超声裂解细胞，300 W，5 s/10 s，30 min。12 000 r/min 4 ℃离心15 min，取上清。采用快速蛋白液相色谱系统AKTA FPLC GE-048，Ni-Sepharose FF预装柱进行蛋白纯化，流速1 mL/min，30 min梯度洗脱，洗脱峰用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)鉴定组分和纯度。采用凝血酶20 ℃酶切过夜，经10 KD超滤管去除凝血酶后，用3 KD超滤管换液并浓缩目的蛋白。采用SDS-PAGE鉴定CD147ICD蛋白纯度。

2 结果

2.1 CD147ICD重组质粒的DNA测序 提取pET-32a(+)/CD147ICD质粒(图1)，经KpnⅠ/EcoRⅤ双酶切后在100 bp DNA ladder上方可见较弱的CD147ICD基因片段，大小符合预期(图2)；测序结果如图3，经序列比对，插入序列正确，无碱基突变和移码突变，证明CD147ICD重组质粒构建成功。

图1 琼脂糖电泳鉴定pET-32a(+)/CD147ICD质粒

图2 酶切鉴定pET-32a(+)/CD147ICD质粒

图3 DNA测序鉴定重组质粒

2.2 TrxA-His6-CD147ICD融合蛋白的表达和纯化 经ExPASy在线工具预测TrxA-His6-CD147ICD融合蛋白的分子量是20.93 KD。采用37 ℃，1 mmol/L IPTG分别诱导2、3、4、5 h。SDS-PAGE电泳结果显示，与未诱导组相比，IPTG诱导2 h后重组菌即可大量表达分子量约为20 KD的目的蛋白(图4)。经超声破碎裂解，高速离心后取上清进行Ni2+亲和层析，纯化得到重组TrxA-His6-CD147ICD蛋白。

图4 SDS-PAGE鉴定TrxA-His6-CD147ICD融合蛋白的表达水平

2.3 酶切、纯化CD147ICD蛋白 经ExPASy在线工具预测，凝血酶酶切后CD147ICD融合蛋白的分子量是7.01 KD。采用凝血酶20 ℃酶切过夜后，经10 KD超滤管去除凝血酶，用3 KD超滤管换液并浓缩CD147ICD蛋白。SDS-PAGE电泳结果显示，纯化后的CD147ICD蛋白在预期分子量7 KD处可见特异性条带，蛋白纯度在95%以上(图5)。采用BCA蛋白定量试剂盒测定纯化后的CD147ICD蛋白浓度，经计算其蛋白浓度为0.74 mg/mL。

图5 SDS-PAGE鉴定纯化的CD147ICD蛋白

3 讨论

肿瘤相关抗原CD147在肺癌、肝癌等恶性肿瘤组织中高表达，靶向CD147的肝癌抗体药物“利卡汀”已批准上市，取得了良好的治疗效果[13]。本实验室前期的研究发现，CD147能够负性调控NO/cGMP介导的细胞钙内流，促进MMP2和MMP9的分泌和活化，继而促进了肿瘤细胞的侵袭和转移，上述作用需要该分子胞内外结构的完整性，其中缺失胞内结构域的CD147对肝癌细胞MMPs分泌、侵袭的调控功能缺失[14]，提示CD147ICD在促进MMPs分泌、调控肿瘤侵袭和转移中也发挥重要作用。Hibino等[15]研究发现，S100A9能够结合于黑色素瘤细胞表面的CD147，促进CD147ICD募集TRAF2，进而促进Cdc42活化和肿瘤侵袭转移，但是CD147与其配体S100A9结合后是如何调控其胞内段募集TRAF2的仍不清楚[16]。目前，针对CD147分子的研究主要集中于胞外段，CD147ICD参与信号转导的分子机制尚不明确，CD147ICD的互作分子鲜见报道。缺乏高纯度的CD147ICD蛋白是制约CD147ICD互作分子鉴定及蛋白质结构解析的重要因素。本研究采用大肠杆菌表达系统对CD147ICD实现高效表达，制备纯度较高的CD147ICD蛋白，为后续制备CD147ICD单抗或多抗、筛选CD147ICD互作分子、解析CD147ICD结构提供基础。

利用PCR扩增得到全长为117 bp的CD147ICD基因，将其连接到pET-32a(+)，获得pET-32a(+)/CD147ICD重组质粒，将其转化Origami B(DE3)感受态细胞，重组菌能够表达20.93 KD的TrxA-His6-CD147ICD融合蛋白，利用Ni-NTA亲和层析法纯化后，采用凝血酶酶切去除TrxA-His6标签，获得纯度约为95%的CD147ICD蛋白，蛋白浓度为0.74 mg/mL。