木本植物组织培养①

吉训志 秦晓威 胡丽松 王晓阳 李付鹏 郝朝运

(中国热带农业科学院香料饮料研究所/农业部香辛饮料作物遗传资源利用重点实验室/海南省热带香辛饮料作物遗传改良与品质调控重点实验室 海南万宁 571533)

植物组织培养技术起初来源于1905年德国植物学家Haberlandt提出的植物细胞具有全能性的概念，即指植物的每个细胞都具有母体的全套遗传信息，拥有能够发育成完整植株的能力，在适宜的条件下，任一细胞都能发育成新个体，植物细胞全能性是植物组织培养的理论基础[1-2]。自Steward等[3]和Reinert[4]利用胡萝卜离体根细胞，经过组织培养下发育成体细胞胚，进而发育成完整植株以来，植物离体再生技术就不断受到国内外学者的关注。植物离体再生的一般过程主要是离体的植物组织，在适宜的培养条件下，通过脱分化形成愈伤组织，愈伤组织进一步发育成体细胞胚，然后体细胞胚经历类似合子胚的发育过程，最终再生成完整植株。近年来，在许多木本植物上都已成功进行了植物组织培养研究， 如桃树[5]、 苹果[6]、 梨树[7]、 荔枝[8]等植物的离体再生技术的研究上都取得了重要的研究成果。虽有一些木本植物已成功建立离体再生体系，但仍有不少木本植物的组织培养研究与组培苗进一步产业化上存在着问题。因此，有必要对木本植物组织培养中的再生方式、关键因素与突出问题等方面研究进行概括与分析，这将有利于木本植物组织研究进一步开展，并提供理论参考。

1 木本植物组织培养中再生方式

1.1 器官发生

植物器官发生是指离体的植物组织，如茎段、茎尖与顶芽等部位，不经过诱导愈伤组织的去分化过程，直接诱导丛生芽与不定根，再生成完整植株的过程。植物的外植体来源及其所处的发育阶段，与不同部分的极性都是影响器官发生的主要因素。并且器官发生对于培养基中细胞分裂素与生长素的比例有着很高的要求，不同的比例常常确定器官发生的方向，这在本文的激素部分已进行了论述。而光照、温度等诱导条件对于植物器官发生也起着重要调控作用，不定芽的生长分化通常需要充足的光照条件，且充足的光照可避免玻璃化苗的出现。

1.2 体细胞胚诱导

体细胞胚诱导是指在植物组织培养中，以植物组织、器官或原生质体等为外植体，经过特定的培养条件，组织细胞脱分化形成快速生长分裂的细胞团，即愈伤组织。然后愈伤组织进一步生长分化，再分化成具有与合子胚一样能够发育成完整植株的无性胚状体结构，称为体细胞胚。

在木本植物组织培养的研究中，大多数的木本植物都是需要通过体细胞胚诱导来完成植株的再生。况且诱导体细胞胚能够极大地发挥植物细胞的再生分化潜力，在荔枝[9]、龙眼[10]与苹果[11]等果树的组织培养中，通过大量增殖愈伤组织，能够诱导获得大量体细胞胚，每个体细胞胚都具有发育成完整植株的潜力，并且可以将这些体细胞胚制作成人工种子，做到对优良种苗资源的高效繁育，蕴含着极大的经济价值。但大量木本植物的体细胞胚诱导，存在体细胞胚诱导困难与诱导体细胞胚不正常的问题，这是制约木本植物组织培养技术发展的瓶颈。

体细胞胚诱导除了与上述外植体、植物激素、培养条件等有着密切的关系，植物的基因型也是一个重要的影响因素。在一种植物的不同品种中，各个品种的体细胞胚发生能力不同[12]。体细胞胚诱导很大程度上取决于愈伤组织的胚性，胚性强的愈伤组织能够自发地分化成高质量的体细胞胚。因此，选用分生能力旺盛的外植体，在适宜的培养条件与激素条件下，获得并保持高胚性的愈伤组织，是体细胞胚诱导的关键。并且体细胞胚诱导在基因转化技术发展方面，能够提供良好的物质基础。

1.3 体细胞胚再生

体细胞胚再生是指体细胞胚经历类似合子胚发育过程，进一步发育成完整植株的阶段。这是植物组织培养技术中最关键的一步，之前对所有因素的探索，都是为了能够获得再生植株。在体细胞胚再生过程中，大多数学者会将培养基中的基本元素与营养物质减半，或不添加任何的植物激素，以充分发挥体细胞胚自身的分化能力[13]。因此，获得高质量的体细胞胚是植株再生成功很重要的关键。

从外植体诱导获得愈伤组织，愈伤组织再进行体细胞胚发生，最后体细胞胚经过生长萌发成拥有根、茎、叶的完整植株，此过程都是在无菌培养条件下进行的异养培养。而再生植株最终是需要进行移栽，自我生长成正常的种苗。从异养到自养的过程中，再生植株需要经历一个适应阶段，不同植物品种的适应能力不同，导致移栽成活的难易程度不一。

1.4 再生植株移栽

再生植株的根系、叶片与茎段等植物器官对于移栽成功十分重要。开瓶炼苗是植株移栽过程中的过渡阶段，目的在于让再生苗预先适应外部环境，光照强度不宜过强，以保护新生的叶片，且避免过强的蒸腾作用，造成叶片萎蔫，使再生苗脱水死亡[14]。而根系中的侧根是植株能够从土壤中吸取养分的最重要组织器官，因此诱导再生植株长出侧根发达的根系对于移栽成活至关重要。

2 木本植物组织培养中的关键因素

2.1 基本培养基

在对植物进行组织培养研究时，首先需考虑培养基选择的问题，而基本培养基的选择是在研究中优先被考虑。现今，依照基本培养基的成分与元素的浓度，大致分为4个类型：富集元素平衡培养基(包括 MS、LS、BL、ER等)， 高硝酸钾含量培养基(包括 B5、N6、SH等)，中等无机盐含量的培养基(包括 H、Nitsch、Miller等)和低无机盐培养基(包括White、WS、HE等)[15]。在绝大多数的植物组织培养中，通常选择MS培养基作为基本培养基，但也需要参照目标植物的近缘物种的相关研究成果进行选择基本培养基。不过，在一般情况下，植物能够适应多种基本培养基，但不同的诱导培养目的，选择最佳的基本培养基不同。

赵雪惠等[16]在对麻疯树的组织培养研究中，以幼胚为外植体，去除胚乳，接种MS、LM、WPM、N6 4种未添加任何植物激素的培养基上进行培养，发现N6早生出胚根，而MS与WPM能够大量诱导出愈伤组织，并且WPM培养基上的分化不定芽数量最多，在不定芽生根中，以LM与WPM培养基的生根诱导率最高，不过WPM培养基上的主根较少，侧根系发达，因此WPM培养基是最佳培养基。虽然基本培养基在植物组织培养中起到支撑作用，但各种培养基都包含了植物生长所需的基本元素，只是其浓度比例不一，并且在实际培养中仍需添加激素、抗氧化剂或一些物质进行补充，使得培养效果达到最佳。

2.2 植物激素

在1905年德国植物学家Haberlandt提出植物细胞具有全能性的概念时，植物组织培养技术就已经开始发展，不过其技术发展历程十分艰辛与缓慢，很大的原因是当时尚未发现对植物细胞生长分化起着促进作用，但其浓度很低的物质，后来这类物质被称为植物激素。目前，天然植物激素因其主要的调控作用，被分为5类：生长素、细胞分裂素、赤霉素、乙烯和脱落酸[17]。由于天然植物激素在植物体内含量极微，因此想从天然来源提取激素十分困难且不经济。在了解天然植物激素化学结构后，现如今已经可以大量人工合成植物激素，并对原有结构进行改变，制成活性更强的植物激素类似物，如常用的2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)、NAA(萘乙酸)与KT(激动素)等物质。自植物激素运用以来，植物组织培养技术不断实现对不同品种植物的离体再生，获得完整植株。

2.2.1 生长素

生长素是最早被发现的一类植物内源激素，参与了植物根和茎的发育、器官的衰老与维管束组织的形成等方面的植物生长分化过程。在植物组织培养研究中，常用的生长素主要包括IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、NAA、2，4-D，其中以2，4-D的活性最强，浓度过高，易引起遗传变异。并且过高的生长素浓度会对木本植物诱导芽增殖起到抑制作用[18]。

王慧梅等[19]在对不同生长素影响喜树组培苗生根的研究中发现，IBA比NAA对诱导生根效果要好，但两者浓度过高都会对生根造成抑制效果，最佳的浓度为IBA 0.5 mg/L。而在对红松的组织培养研究中，也获得了相似的结果，在生长素类激素含量较高时发生不定根[20]。何业华等[21]在对枣树愈伤组织形成的不定芽进行不定根诱导的研究中发现，IBA效果最好 ,其次是 IAA,NAA生根率低，并且仍会有大量愈伤组织生成，而2，4-D主要以愈伤组织诱导为主。

2.2.2 细胞分裂素

细胞分裂素是在组织培养中另一种重要的植物内源激素，通常与生长素一起使用，两者相辅相成，能够达到更好的培养效果。细胞分裂素大致可分成两类,一类是嘌呤型细胞分裂素(CTK),另一类是苯基脲型细胞分裂素(PUD)。植物组织培养中常用的第一类嘌呤型细胞分裂素，包括BA(苄基腺嘌呤,又称 6-BA,BAP)，KT(激动素,KIT,KIN)，2IP(2-异戊烯基腺嘌呤)，ZEA(玉米素,即异戊二烯腺嘌呤,又称ZT)。苯基脲型细胞分裂素是新型的细胞分裂素，其中TDZ(噻苯隆)是人工合成的一种植物激素，因具有高度的细胞分裂素活性，也常被使用。在对红松和枣树的组织培养研究中，发现细胞分裂素BA对诱导不定芽的效果较好，不过BA会抑制不定根的产生。杨振国等[22]在防止酸樱桃组培苗玻璃化的研究中，发现BA会提高玻璃化率，而KT对玻璃化无影响。Huetteman等[23]在探讨TDZ对于木本植物组织培养中的影响认为，TDZ能够促进许多再生困难的木本植物品种完成微繁殖过程，在浓度低于1 μmol/L时，能够使腋芽增殖，但可能抑制芽的伸长；在浓度高于1 μmol/L时，能够刺激愈伤组织的形成、诱导丛生芽与体细胞胚发生。

2.2.3 赤霉素

赤霉素至今已发现100多种，总称为赤霉素类(GAs)。其中只有少数赤霉素对植物的生长发育具有生物活性，在木本组织培养的研究中应用较多的是GA3。GA3的作用类似于生长素，但与其不同的是，GA3对完整植株的作用要强于对离体器官或组织的作用。GA3可刺激器官的生长，却抑制器官的发生，如GA3对不定根的产生具有抑制作用，但在根原基形成以后，则不对不定根的发生造成影响[24]。

郑启发等[25]在对龙眼和荔枝的组织培养研究中发现，GA3对两者的愈伤组织诱导具有抑制作用，应该省去不用。林妃等[26]在对白木香组织培养技术及植株再生的研究中发现，GA3仅对种子萌发具有促进作用，其余诱导器官发生的部分都不宜使用。而在宿静等[27]对于美国月桂樱组织培养研究中发现，GA3对芽的伸长没有效果。据相关报道，赤霉素能促进植物开花，但对于植物离体再生作用较小，尚没有广泛运用。

2.2.4 乙烯

乙烯是一种气态的植物激素，广泛存在于植物成熟的果实果皮中，对催化果实成熟有促进作用。而乙烯对于植物组织培养作用方面的研究尚少。Kumar[28]和Biddington[29]都对乙烯在愈伤组织诱导、体细胞胚发生、不定芽与不定根的诱导等相关研究进行了概述，表明了乙烯在不同植物品种中具有起到的作用不一，而在木本组织培养中，乙烯的作用很少涉及。谢耀坚[30]在对欧洲云杉胚性愈伤组织培养中乙烯的释放及其作用的研究中，发现乙烯释放量的变化对胚性愈伤组织的诱导率无明显促进或抑制作用。乙烯在木本植物组织培养方面的作用仍需进一步研究。

2.2.5 脱落酸

脱落酸作为五大类激素之一，对植物细胞分裂扩增起着重要调控作用，而且经常在组织培养方面，通过提高愈伤组织的干燥耐受性和防止提早发芽，从而促进体细胞胚的发生与提高体细胞胚的质量。脱落酸不只调节植物细胞的生长发育，还在植物细胞受到胁迫时发挥作用。因此，脱落酸以其在植物生长发育中所起的独特作用，近年来不断受到科学家的青睐，研究深度与广度逐步增加。

Bawis等[31]进行了脱落酸对棕榈树体细胞胚发生的影响研究，发现添加0.1 mg/L脱落酸时，促进的体细胞胚发生量最大，浓度过高则会减少体细胞胚的发生量。Alwael等[32]同样以棕榈树为研究对象，发现运用悬浮培养方式，与添加50～100μmol/L的脱落酸浓度对同步化诱导体细胞胚具有促进作用。Fernando等[33]在利用未成熟的椰子种子为外植体，进行愈伤组织诱导后，以添加7.5 μmol/L的脱落酸浓度，体细胞胚发生量最大，但无法进一步萌发出芽，而2.5～5 μmol/L的ABA浓度，可以成功生出芽。

2.3 碳源

在对植物细胞进行组织培养时，除了需要添加植物激素，与基本培养基所提供的基本营养元素外，生长发育主要所需的能量物质是由碳源物质所提供的。碳源一般是糖类物质，常用的碳源物质有蔗糖、葡萄糖、果糖与半乳糖等。其中蔗糖与果糖，在植物组织培养中最为广泛运用。碳源不只是为植物细胞提供能量物质，还能为植物细胞提供渗透压，提供细胞吸取养分的动力，而渗透压与碳源的种类与浓度密切相关。

蔗糖是植物组织培养中，最常用的碳源物质，属于非还原性二糖。蔗糖在供能外，还能促进愈伤组织的再分化。由于植物细胞对蔗糖的吸收速率较慢，因此蔗糖能够长期保持较稳定的渗透压，为植物细胞生长发育提供稳定的环境。而且蔗糖一般不能被微生物直接利用，对微生物的污染有一定程度的减轻效果。

张小苹[34]利用不同碳源对桑树茎尖进行培养时，发现果糖是桑树诱导芽尖与继代培养效果最佳的碳源，而葡萄糖可在继代培养中替代果糖，达到更好的培养效果。谢志兵[35]利用不同碳源对猕猴桃的组织培养研究中发现，蔗糖和葡萄糖对芽的分化效应无明显差异，不过低浓度的碳源不能很好地进行芽分化和生长，而高浓度的碳源虽能较好地诱导芽分化，但抑制了后期芽的生长。在植物组织培养中，一般多用蔗糖作为培养基碳源，对于个别植物的组织培养则以葡萄糖与果糖这些单糖作为碳源更佳。因此，对植物组织培养中碳源种类与浓度的选择也是必不可少的关键环节。

2.4 pH值

pH值在植物组织培养研究中，通常代表着培养基中的酸碱度。大多数植物在离体培养中，pH值的要求5.0～6.2。适宜的pH值，是植物组织离体再生过程中能够正常吸取生长养分的重要影响因素。并且pH值能够影响培养基的凝固程度，当pH较低(≤4.0)时，加入一定量的凝固剂，培养基都难于凝固。而培养基的凝固程度对培养物的支撑作用，对其保证正常生长发育具有重要意义。

周再知等[36]在钙离子与pH值对柚木组培苗生长和矿质养分吸收影响的研究中发现，pH值对苗高生长及愈伤组织生物量积累有显著影响，适宜pH值为6.0，只有稳定在最适pH值上，增加钙离子浓度，才会增加柚木组培苗的营养元素吸收。李欣怡等[37]对3个越橘品种组培苗在pH值5～9条件下培养发现，不同越橘品种在相同pH值条件下生长状况不一致。因此，表明pH值是影响植物组织培养的关键因素之一，而且不同植物品种的最适pH值都有所不同。

3 影响木本植物组织培养的突出问题

3.1 外植体灭菌

外植体消毒灭菌，是植物组织培养技术中关键的一步。不仅要求对外植体进行彻底灭菌，还要尽可能地减少对外植体细胞的伤害，保证植物细胞仍具有旺盛的生长分化能力[38]。在植物生长过程中，如顶芽、茎和叶等许多植物组织，常年暴露在外界环境中，容易附生或共生多种微生物，并且微生物可侵入组织内部，致使外植体消毒灭菌困难，易造成内生菌污染。由于热带、亚热带地区常年高温多雨，空气湿度大，使得内生菌污染现象更为严重。因此，选取含菌较少且生长分化能力较强的植物组织作为外植体，在适宜的灭菌方法下进行外植体消毒灭菌，是建立植物无菌培养离体再生的关键。

方庆等[39]对桃的茎段进行升汞、次氯酸钠和乙醇3种灭菌方法发现，以乙醇加0.2%升汞灭菌9 min的组合效果最佳；马兰珍等[40]对不同来源的杂交松外植体采用不同的灭菌方法进行试验发现，不同环境下的外植体带菌程度不同，来自于林学院苗圃的外植体在75%酒精与0.1%升汞5～6 min灭菌下效果较好，而来自于东门林场苗圃及林业局种苗基地的外植体以上方法都不理想，可能与其周围环境的微生物较多有关；岑湘涛等[41]在对杧果茎段离体培养中外植体选择与灭菌方法进行了探索发现，以室内沙培杧果带腋芽的茎段在乙醇消毒30s后0.1%升汞灭菌8 min的腋芽萌发率较高。

前人对外植体灭菌大部分采用表面灭菌，常用的灭菌剂有乙醇、次氯酸钠、升汞与高锰酸钾等，通常需要将不同灭菌剂进行组合使用，以求达到最佳的灭菌效果。同时要严格控制灭菌时间，如升汞在灭菌过程中，时间过短，杀菌不彻底，易导致外植体污染严重，而时间过长，则会对组织细胞起到杀伤作用，最终使外植体死亡。因此，应尽量选择含菌较少，生长能力强的植物组织作为外植体。

3.2 外植体褐化

外植体褐化有两种形式：一种是酶促褐化，指在植物组织培养过程中，外植体材料由于自身多酚氧化酶作用，将酚类物质氧化成醌类物质，并向培养基中释放，致使培养基变褐，影响外植体细胞的正常生命代谢活动，毒害整个外植体组织，最终逐渐死亡；另一种是非酶促褐化，常是由于外植体自身细胞受外界环境不利因素影响，造成的细胞坏死，或发生细胞程序性死亡的褐化现象。

王玖瑞等[42]在利用枣幼胚建立离体培养时发现，外植体褐化是枣幼胚离体培养的关键问题，而剥去胚珠中的珠被后再进行接种，可有效防止外植体褐化。邬秀宏等[43]在对茶树组织培养的外植体褐化现象控制方面进行探索发现，外植体表面消毒以6 min为宜，并且Vc和核黄素对防止茶树外植体褐化均有良好效果。付凤玲等[44]在对桑树茎尖培养的外植体褐化的控制研究中发现，活性炭、聚乙烯吡咯烷酮、Na2S2O3以及用 8-羟基喹啉等抗氧化剂对外植体褐化具有很好的控制作用，不过活性炭对茎叶生长有抑制作用，而聚乙烯吡咯烷酮副作用较小，是理想的抗氧化剂，能添加到培养基和对外植体进行前处理。张小红等[45]在对核桃离体培养外植体褐化的研究中发现，幼嫩的外植体比半木质化与休眠期的外植体更容易发生褐化，液体培养能够减轻褐化，植物激素6-BA、IAA与GA也能够减轻外植体的褐化程度，硫代硫酸钠对外植体防褐化、提高外植体萌芽率与有效新梢率有促进作用。

3.3 愈伤组织褐化

愈伤组织褐化是植物组织培养继代过程中普遍存在的现象，表现为从愈伤组织团块一小部分组织开始褐变发黑，随后褐化逐渐蔓延整个愈伤组织，致使愈伤组织停止生长分化，直至死亡。将初代培养出生长状态良好的愈伤组织进行继代培养，一方面能够为愈伤组织提供新的培养条件，加快愈伤组织的生长速度，由于褐化主要与组织细胞内多酚氧化酶在氧化酚类物质成醌类物质有关，所以愈伤组织在快速生长的同时，愈伤组织褐化也随之加快，从而影响植物组织培养后续正常进行[46]。因此，控制愈伤组织褐化是保障许多植物组织培养顺利完成的重要步骤。

对于控制愈伤组织褐化现象的研究，前人主要是从抗褐化剂、植物激素、培养方式等方面进行探索。陈剑勇[47]使用维生素C、柠檬酸、半胱氨酸、硫代硫酸钠 4种抗氧化剂对杉木愈伤组织进行防褐化研究发现，维生素C与半胱氨酸能有效抑制褐化，且对愈伤组织生长没有明显的抑制作用。张彦波等[48]在对喜树愈伤组织抑制褐化的研究中发现，在愈伤组织继代过程中SH培养基比MS培养基的愈伤组织褐化率要低，并且加入抗坏血酸与活性炭也能有效降低愈伤组织褐化率。唐利球等[49]在对金钱树愈伤组织继代中，采用液体培养与使用N6培养基都能够改善愈伤组织在继代过程中的褐化现象。张明文等[50]在银杏组织培养的愈伤组织继代褐化方面研究发现，培养基中添加不同浓度与种类的糖，造成渗透压不同，5%蔗糖浓度对防褐化效果最好，并且不同品种的银杏在愈伤组织继代过程中，褐化程度不同。

4 结语

木本组织培养技术通过这些年的发展，虽然已经在不少木本植物品种上取得一定的进展，但普遍仍存在体细胞胚诱导困难，组培苗移栽成活率低，难以真正实现优良种苗的高效繁育的问题[51-53]。对于许多木本植物尤其是热带作物，因处于高温高湿的环境下，导致进行组织培养时，内生菌污染严重。木本植物的组织培养技术在不同品种上的发展进度严重不一致，由此笔者希望通过对不同木本植物品种组织培养技术进行概述，让组织培养技术发展存在瓶颈的植物品种能够参考其他相近品种的成功案例，从外植体消毒灭菌、基本培养基的选择、不同植物激素的配比与培养方法等方面有所突破，完成对优良种苗、珍稀物种、工厂化操作的快速高通量繁育的目标。