sFRP-2抑制皮肤恶性黑色素瘤增殖的影响

赵振霞 董华君 于强 陈新 蹇露

(1.山东省聊城市第二人民医院整形外科，山东 聊城 252600；2.湖北医药学院附属太和医院病理科，湖北 十堰 442000)

皮肤黑色素瘤(Cutaneous melanoma，CM)是一种极具侵袭性的癌症，生存率低，死亡率高[1-3]。早期手术切除以及放化疗为主的综合治疗是临床中CM的主要治疗方案，但CM极易发生转移，一旦发生转移患者的预后通常较差；且化疗药物对绝大多数CM患者没有疗效或表现出肿瘤耐药性，这使得治疗无效。近年来分子生物学和肿瘤表观遗传学的深入研究，研究者提出肿瘤的发生与癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相关；各种基因的异常表达导致细胞逃避正常机体生理调控功能，出现增殖异常和凋亡失控等现象。因此临床中寻找早期诊断与判断CM预后的靶点具有重要意义。sFRP-2是WNT信号通路的负调控因子，是一种分泌性糖蛋白，作为一个负调控因子参与多种肿瘤细胞生长、细胞免疫、干细胞分化等[4-5]。已有文献报道在包括头颈部肿瘤、前列腺癌等肿瘤中具有重要的抑癌作用[6-7]。但对其参与CM的研究的甚少。本研究旨在评估sFRP-2对CM侵袭和转移的功能和分子机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1试剂、材料仪器 胎牛血清和RAPI-1640培养液购自美国Gibico公司；RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购自日本TaKaRa 公司；Trans5α 感受态细胞、293T 细胞购自天根生化科技有限公司; Lipofectamine 3 000脂质体转染试剂盒购自美国Invitrogen 公司;慢病毒质粒载体pLVX-IRES-ZsGreen1 购自美国ProliantProliant公司；质粒载体sFRP-2、质粒载体包装质粒购自上海碧云天实验公司; CCK-8 试剂盒购自日本同仁化学实验公司。实验用一抗、二抗均购自美国Abcam 公司。sFRP-2 基因引物由广州复能基因公司设计并合成。

1.2细胞系和临床组织样本 黑色素瘤细胞系(HM、A375、WM451和SK-MEL-1)购自上海生科院细胞库；对2005年1月至2018年12月于本院收治并由两名以上病理科高年资医师确诊的并收治的共80例CM患者的临床病例样本。在这些患者中男49例以及女31名。年龄范围在29～76岁之间，中位年龄49.7岁。所有病人临床分期依据第8版AJCC版TNM分期，其中Ⅰ期13例、Ⅱ期22例、Ⅲ期28例及Ⅳ期17例。在2005～2018年的持续随访过程中共死亡56例，存活24例。本研究得到了我医院的伦理委员会的批准，组织标本诊断由我院病理科高年制医师诊断。

1.3实验方法

1.3.1细胞和组织RNA和蛋白提取 CM细胞和组织的RNA和蛋白以及上述临床样本中RNA和蛋白提取步骤同已有的文献报道[8-9]。提取后RNA在Landdrop仪器中测得浓度，通过RNA逆转录试剂盒将RNA逆转为cDNA，实验方法及步骤参考样品实验说明书及已有的参考文献[10]。将逆转录后的cDNA放于-20 ℃冰箱中保存。

1.3.2sFRP-2过表达载体构建和细胞感染 慢病毒感染方法和步骤同参考文献[11-12]。取细胞状态良好，处于对数生长期的293T细胞接种于10 cm细胞培养皿，37 ℃，5% CO2培养箱内培养;参照Lipofectamine 3 000使用说明，将包装质粒共转染293T细胞，转染后8h更换为完全培养基，继续培养48 h后；收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，进行细胞感染。慢病毒感染方法：取活性状态下A375细胞，将慢病毒上清液置于A375细胞中共培养约6～8 h，更换完全培养基后继续培养48 h，进行细胞功能实验。

1.3.3免疫组化实验 免疫组化方法和步骤同参考文献[13]，主要包括了：组织切片脱蜡(3 μm，60 ℃，2 h)、脱缸(10 min/次)、抗原修复[热诱导抗原表位修复、柠檬酸盐缓冲液(pH=6)，30 min]、H2O2室温下封闭(室温下2h)、孵一抗(4 ℃冻库，12 h)和二抗(37 ℃，2 h)、DAB显色(室温下5 min)、染核(苏木紫及伊红复染，室温下5 min)、封片镜检等。在倒置显微镜下随机5个视野，计算相对光密度。选用已知阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。根据病理评分标准：独立评估阳性肿瘤细胞的相对数量(范围：0%～100%)和染色强度(范围：0～3分：0分=无染色，1分=弱染色，2分=中度染色，3分=强染色)。

1.3.4qRT-PCR检测sFRP-2在组织表达 qRT-PCR的步骤同试剂盒使用说明书和文献所述[14-15]。sFRP-2-F：5’-CGTCAGAAGAAGCTGCTGCTCC-3’，sFRP-4-R：5’-TAATGGTCTCCACAGCACTCATA-3’。使用HT7500生物系统以及SYBRGreen的试剂盒。通过实时监测PCR扩增，选择β-actin为内参基因，每个样品做三个重复；用2-△△Ct法对样本基因进行表达差异相对定量分析，在扩增的指数期对起始模板进行定量，扩增指数越高，相对表达越高。

1.3.5细胞增殖实验 对照组和实验组的细胞处理同前，取对数生长期的细胞进行消化，按每孔3 000 个细胞接种96孔板，完全培养基过夜培养。待细胞完全贴壁后，实验前3 h在各孔中分别加入20 μL CCK-8试剂，培养0、24、48和72 h时分别检测细胞增殖活性，通过酶联免疫检测仪在波长480 nm 处检测各孔的D值，根据D480 nm值绘制细胞生长曲线。

1.3.6软琼脂平板克隆实验 软琼脂平板克隆实验方法和步骤同参考文献[15]。取对数生长期实验组和对照组细胞，消化、离心、计数；将细胞稀释成1×103细胞/mL备用。蒸馏水分别制备出1.3%和0.8%两个浓度的低溶点琼脂糖液。分别使用1∶1比例将琼脂糖液与1 640完全培养液混合后，平铺于平皿中自然冷却凝固形成双侧琼脂层。待上层琼脂凝固后，置于细胞孵育箱中继续培养约两周；观察克隆形态并计数。以上实验组和对照组各重复三次。

1.3.7免疫蛋白印迹实验 蛋白质印迹法检测 A375在细胞系中的相对表达：收集实验组和对照组，提取细胞蛋白后测定蛋白浓度[16]。取50 μg/孔细胞蛋白进行凝胶电泳，常温下将电泳分离后的蛋白转膜于PVDF膜上，5%脱脂牛奶的TBST室温下封闭2 h，加入一抗及内参GAPDH(美国Abcam公司)，4 ℃冻库封闭过夜。24 h后常温下复温约30 min，TBST液洗膜后，二抗封闭液室温下摇床孵育2 h，显色剂(DAB)显色、成像仪曝光，并用Quantity One软件分析蛋白灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参GAPDH之比来表示相对表达差异。

2 结 果

2.1sFRP-2 mRNA在黑色素瘤细胞系和组织中的表达 qRT-PCR实验发现，与正常色素痣相比，sFRP-2 mRNA在黑色素瘤细胞系中表达下调(图1A，P<0.001)，差异具有统计学意义。同时qRT-PCR发现，与癌旁组织相比，sFRP-2 mRNA在黑色素瘤组织中表达下调，差异有统计学意义(图1B，P<0.001)，差异具有统计学意义。

(A)qRT-PCR显示：与色素痣相比，sFRP-2 mRNA在黑色素瘤细胞中表达下调；***P<0.001.(B)qRT-PCR显示：与癌旁组织相比，sFRP-2 mRNA在黑色素瘤组织中低表达，P<0.001。

图1sFRP-2 mRNA 的表达

2.2sFRP-2 蛋白在黑色素瘤组织中的表达 通过免疫组织化学分析80例黑色素瘤组织和色素痣的蛋白相对表达；结果显示：与色素痣相比，sFRP-2 蛋白在黑色素瘤组织中表达下调(图2A)，差异具有统计学意义。通过IPP 6.0软件分析 sFRP-2 蛋白表达光密度显示，与色素痣组织相比(0.324±0.012)，sFRP-2 在黑色素瘤中光密度降低(0.123±0.034)(图2B，t=15.34，P<0.01)。

(A)与正常色素痣相比，sFRP-2 蛋白在黑色素瘤中表达下调；(B)光密度分析：sFRP-2 蛋白在黑色素瘤中表达下调，P<0.01。

图2sFRP-2 蛋白在黑色素瘤中的表达

2.3sFRP-2蛋白表达与患者临床特征的关系 sFRP-2 的表达与不同性别、不同年龄的基线特征无明显统计学意义(P>0.05)；随着病理分级增加，sFRP-2 蛋白在黑色素瘤组织中阳性率逐步降低，差异有统计学意义(P=0.034)。见表1。

表1 临床特征与 sFRP-2 蛋白表达的关系

2.4sFRP-2表达对患者生存时间的影响 sFRP-2 高表达患者中位生存时间为 56.12 个月，其三年存活率为56.78%; sFRP-2 低表达患者中位生存时间为 26.62 个月，其三年存活率为22.19%。Log-Rank 检验结果提示 sFRP-2 高表达患者与 sFRP-2 低表达患者生存时间的差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 sFRP-2 蛋白的表达情况与K-M 生存曲线

2.5sFRP-2 基因过表达对黑色素瘤细胞增殖的影响 我们对黑色素瘤细胞 A375 进行 sFRP-2 基因过表达，免疫蛋白印迹实验验证了sFRP-2的过表达(图4A)。CCK-8实验结果显示，实验组 A375 细胞感染sFRP-2后细胞存活率显著下降(图4B，P<0.01)；克隆形成实验结果显示，实验组 A375 细胞克隆形成的效率显著下降(图4C，P<0.001)。

(A)免疫蛋白印迹实验验证sFRP-2在A375中的过表达；(B)CCK-8实验sFRP-2抑制细胞活性，P<0.01；(C)软琼脂平板克隆显示sFRP-2 在抑制细胞克隆的形成，***P<0.001。

图4sFRP-2表达对黑色素瘤细胞A375增殖的影响

2.6过表达sFRP-2对 Wnt/β-catenin 信号通路的影响 通过免疫蛋白质印迹检测过表达 sFRP-2 后对active-β-catenin及下游靶基因的影响，结果显示：过表达 sFRP-2 后，active-β-catenin及下游靶基因c-Myc、cyclinD1的表达明显受到抑制；同时细胞周期相关蛋白p21 和 p27等表达上调(图5A，5B，P<0.001)。

(A)免疫蛋白印迹实验分析过表达sFRP-2对Wnt/β-catenin信号通路的影响；(B)灰度定量分析过表达sFRP-2对Wnt/β-catenin信号通路相关靶点的影响，两组比较，***P<0.001。

图5sFRP-2 过表达后对Wnt/β-catenin信号通路的影响

3 讨 论

黑色素瘤的发病率在皮肤肿瘤中仅次于鳞状细胞癌和基底细胞癌，是最常见的三种皮肤癌的类型之一。其具有高度转移潜能，能在淋巴结、肝、肺和脑等部位发生转移；是目前死亡率最高的皮肤肿瘤。尽管发病率不高，但世界范围内患有黑色素瘤的人数不断增加，且黑色素瘤患者的预后仍不理想，平均生存期不到6个月。针对黑色素瘤的治疗方法取得了巨大的发展：包括达巴芬尼、维穆拉芬尼和曲美替尼等激酶抑制剂用于BRAF V600E突变患者，单克隆抗体，PD-1的免疫治疗等[17]。但黑色素瘤患者的预后和生存率仍然不佳。因此，迫切需要寻找早期预测黑色素瘤发生发展和预后的治疗靶点。

Wnt 信号调节因子 sFRPs 因其在肿瘤中的作用而备受关注。作为sFRPs家族成员之一，sFRP-2作为一种抑制基因在多种肿瘤的发生发展中起着重要的作用。文献报道[18]， sFRP-4在头颈部/口腔鳞状细胞癌中表达上调；高表达的sFRP-4在头颈部/口腔鳞状细胞癌容易发生远处转移且预后较差。sFRP-5在黑色素瘤中低表达，sFRP-5 的表达可能在黑色素瘤的侵袭和转移中发挥潜在的作用，并作为人类黑色素瘤治疗的一个有希望的靶点[18]。但 sFRP-2表达对黑色素瘤的影响尚未见报道和研究。

本研究首先通过qRT-PCR 和免疫组化法分别检测了 sFRP-2 在黑色素瘤细胞系和组织中相对表达，结果显示：sFRP-2 在黑色素瘤细胞和组织中的表达下调，并可能在黑色素瘤进展中发挥关键作用。因此，我们采用慢病毒转移来过表达 sFRP-2，通过CCK-8和软琼脂平板克隆实验验证 sFRP-2对黑色素瘤细胞的直接生物学效应。结果表明，sFRP-2 的过度表达能明显抑制细胞增殖和细胞活性。同时，对 sFRP-2 表达的临床病理特征进行了进一步分析，结果发现：在排除了性别、年龄与 sFRP-2 表达可能存在的相关性的情况下，sFRP-2 表达可能与黑色素瘤的生存有密切的关联。有研究认为在一些肿瘤中 sFRP-2 高表达能增加患者的生存期，本本研究得到了相似的结论。文献研究显示，sFRPs 家族对多种肿瘤的Wnt信号都有拮抗作用，我们通过 Western blot 分析检测了 A375 细胞中 Wnt 信号通路的蛋白表达水平，以探讨 sFRP-2 抑制黑色素瘤细胞增殖的分子机制。结果显示sFRP-2 的过表达下调了 Wnt/β-catenin 及相关通路中关键因子的蛋白表达，表明 sFRP-2 抑制了典型 Wnt 信号。

综述，本课题研究显示 sFRP-2 基因在黑色素瘤组织中表达下调，过表达 sFRP-2 基因后能通过抑制Wnt/β-catenin来调控黑色素瘤的进展；可能作为重要的肿瘤性基因参与黑色素瘤的发生发展。