液质联用技术应用于药理学实验教学的探索

高越颖，刘 蕾，惠人杰

(江南大学 药学院，江苏 无锡 214122 )

0 引 言

制药工程专业是培养具有新药研究与开发的基本能力，能够解决制药工程实际问题能力的人才，注重的问题是如何评价所产生药品的药学质量。药理学实验教学正是培养这种能力的主要学科之一。近年来，我院药理学实验教学不断更新实验教学项目，增加开放设计创新实验，以培养学生药物评价能力、科研创新能力及解决制药工程实际问题的能力[1-3]。

药物代谢动力学研究是药理学实验的重要内容，对药物研究开发、临床合理用药和药品质量控制具有重大的理论和实用价值[4-5]，但传统教材中的研究对象(如溴磺酞钠/水杨酸钠)及血药浓度分析方法(紫外分光光度法)较为陈旧，不利于激发学生学习兴趣及科研创新能力的培养。液相色谱-质谱联用技术为现代分析技术中的成熟技术，广泛应用于科研及制药行业[6-9]，一般本科实验教学中对该类技术的介绍较少。为此，课程结合学院科研成果，引入现代分析技术，设计了题为“化合物X在小鼠体内药物代谢动力学研究”实验。以学院自主研发的一种新型抗血吸虫化合物——吡喹酮类似物为研究对象，采用液相色谱-质谱联用技术作为血药浓度分析方法，研究了该化合物在小鼠体内的药物代谢动力学特征。通过该实验，学生不仅能巩固药理学基础理论知识和动物实验基本实验操作技能，也能深入、全面、系统地掌握一般化学药物的药物代谢动力学实验的设计原则与研究方法，了解和掌握前沿分析测试技术，切实提高了学生综合运用知识的能力。

1 实验材料和仪器

1.1 仪 器

Quattro LC MicroMass三重四级杆质谱仪，2695型液相色谱仪，美国Waters公司；vortex3000涡旋震荡混匀仪，德国WIGGENS公司；TGL-16G离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.2 材料与试剂

吡喹酮类似物为本实验自制；吡喹酮(PZQ)对照品(潍坊三江医药化工公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，TEDIA)；超纯水。

1.3 实验对象

ICR小鼠，雄，SPF级，体质量(18～22 g)，由扬州大学实验动物中心提供。

2 实验方法

2.1 色谱条件及质谱条件

(1)色谱条件。色谱柱：Luna 3u C18(2)柱 (2×100 mm，3 micron)；流动相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)；流速：0.3 mL/min；柱温：35 ℃。流动相梯度洗脱比例见表1。

表1 HPLC-MS/MS流动相梯度洗脱条件

(2)质谱条件。离子源：电喷雾离子化源(ESI)；正离子模式；毛细管电压3.32 kV；锥孔气流量45 L/h；脱溶剂气温度：350 ℃；离子源温度：100 ℃；脱溶剂气流量550 L/h。质谱检测器选择性监测条件见表2。

表2 HPLC-MS/MS质谱检测器监测参数

2.2 溶液制备

(1)对照品溶液。精密称取吡喹酮类似物50 mg，置于50 mL容量瓶中，加入100%甲醇溶解并定容，得到1 g/L母液，精密吸取母液用乙腈稀释成 7.0，5.0，3.0，1.0，0.10 mg/L的系列样品。

(2)内标溶液。精密称取内标5.0 mg置于25 mL容量瓶中，加入100%乙腈溶解并定容，得到0.2 μg/mL 的内标母液。

2.3 血浆样品处理

取血浆样品100 μL，置2 mL离心管中，加入吡喹酮内标溶液10 μL(0.2μg/mL)，乙腈240 μL，涡旋60s，离心8 min(12 000 r/min)，取上清经自动进样器进样10 μL，进行HPLC-MS/MS分析。

2.4 标准曲线的制备

取7.0，5.0，3.0，1.0，0.10 mg/L乙腈溶解的吡喹酮类似物 10 μL，加入到90 μL小鼠空白血浆中，按“2.2”项下方法进行处理测定。以吡喹酮类似物的峰面积A1/内标峰面积A2为纵坐标，浓度C (μg/L)为横坐标，绘制标准曲线。

2.5 药物代谢动力学试验

雄性昆明种小鼠24只，随机分成3组，实验前禁食12 h，自由饮水，按20 mg/kg灌胃吡喹酮类似物溶液。于给药后0.5、1、2、2.5、3、4、5、6 h，每个时间点分别从各组取1只小鼠，摘眼球取血，置于1.5 mL离心管中(肝素预处理抗凝)，离心(3 500 r/min,5 min)，取血浆，按“2.4”项下方法进行处理测定，计算血浆吡喹酮类似物浓度。将各时间点数据用DAS2.0软件计算药物代谢动力学参数。

3 结果与分析

3.1 标准曲线

按“2.4”项下方法分析结果，计算出相应的回归方程：A1/A2=0.046 9C+2.324 8，R2=0.998 2，结果表明吡喹酮类似物在10～700 μg/L范围内线性关系良好，见图1。

图1 吡喹酮类似物的标准曲线

3.2 药物代谢动力学参数

小鼠灌胃吡喹酮类似物溶液后，各时间点测得的平均血药浓度见图2。用DAS2.0软件拟合，其药物代谢动力学特征用统计矩参数表示，结果见表3。研究结果显示，吡喹酮类似物单次给药在1.667 h左右达到最大浓度，其最大浓度为61.067 μg/L，血浆消除半衰期T1/2为9.569 h。

图2 血浆中吡喹酮类似物的浓度-时间曲线(n=3)

表3 吡喹酮类似物的主要药物代谢动力学参数

4 讨 论

4.1 课程设计

本设计性实验由学生根据已有资料及实验室条件自行设计，老师组织学生对实验方案进行论证，选取最优方案进行实施，实验实施过程中教师进行适当指导。

临床前药物代谢动力学主要研究内容包括：血药浓度-时间曲线、吸收、分布、排泄、与血浆蛋白的结合、生物转化、对药物代谢酶活性的影响等内容。本文选择“血药浓度-时间曲线”进行研究，实验过程大致如下：将目标化合物通过适当方式给予受试动物，然后按照一定的时间间隔采集血样，采用合适的分析方法测定血样中的药物浓度，由此得到一系列的血药浓度对时间变化的数据，从而求出药代动力学参数。全班分3大组，每组负责完成一条药-时曲线的样本采集，即每个时间点从一只小鼠取血、取材，则全班每个时间点的重复数为3(n=3)，给药、取血、血浆样品处理及血药浓度测定等步骤分别由同一位学生完成，以保证给药、取血时间的一致性，以及检测结果的准确性，减少由不同学生取血造成的组内误差，由表3可见存在一定的组间误差，有可能由于不同组间取血人员的不同造成。但实验过程中小组成员既有分工又有合作，每位学生均能参与操作并能了解到完整的实验过程，对学生的团队协助精神很有帮助。

样品测定前由带教老师先调试好仪器，由同一位学生完成标准品溶液的配置及检测，并用同一台仪器进行检测；各组学生只需进行血浆样本的处理，并通过0.45 μm滤器过滤到进样瓶中，放到自动进样器中，等待自动进样分析。

4.2 实验内容的拓展

考虑到实验课时的限制，在完成教学任务、保证教学质量的基础上，课堂上选择重点、有代表性的实验内容完成，其他内容作为选做实验或开放实验环节，供学生课后完成。

药物代谢动力学研究内容中的“组织分布”内容，课堂上完成心、肝、脾、肺、肾、胃肠道、脑等组织的取材，供学生课后进行组织中药物浓度的测定，以了解药物在体内的主要分布组织。

液质联用分析方法学部分，将线性关系考察、样品前处理及样品测定作为重点掌握的内容。仪器结构介绍、工作原理、使用注意事项、等相关知识点作为学生课前预习内容。一般方法学分析包括：线性关系的考察、色谱、质谱条件的优化，专属性、稳定性、精密度、回收率等实验[10-12]。课题组前期通过大量预实验完成了该化合物含量测定的方法学研究，检测方法灵敏、稳定、可靠。为了让学生完整、系统了解分析方法的建立，线性关系内容之外的部分由学生课后参与或独立完成。

4.3 数据分析及报告撰写

(1)标准曲线的配制及样品血药浓度的测定。实验结果由带教老师整理，学生根据吡喹酮类似物及内标的峰面积，通过Excel、Graphpad Prism 5等软件绘制标准曲线并建立线性回归，各时间点的血药浓度根据标准曲线求得。通过对标准曲线结果的分析，学生可以探讨标准曲线的浓度范围及梯度设置是否合理,通过何种指标判断线性关系是否良好，跟哪些操作过程有关。

(2)药物代谢动力学参数计算。学生可以根据所学理论知识利用公式进行计算，该方法的优势在于可以帮助学生加深药物代谢动力学概念的理解及公式的推导计算过程。此外，也可以通过药物代谢动力学数据处理软件DAS2.0等进行计算，该方法可以帮助学生掌握药物代谢动力学软件的使用，迅速得到相应的药物代谢动力学参数，另一方面可以验证公式推导的计算结果是否正确，准确分析药物的体内过程，大大提高教学效率及质量。

(3)实验报告。实验完成后学生需撰写实验报告，并就实验中存在的问题进行交流和讨论，总结实验的得失。例如，按照新药指导原则，采样时间点的设计应兼顾药物的吸收相、平衡相(峰浓度附近)和消除相。一般在吸收相至少需要2～3个采样点，整个采样时间至少应持续到3～5个半衰期，或持续到血药浓度为Cmax的1/10～1/20。从图2来看，取血时间点欠佳，应考虑增加吸收相的取血点；由表3可见，药物血浆半衰期t1/2z=9.569±8.077 h，而取样时间只到6 h，应延长采血时间，保证结果的可靠性。该过程需要学生对实验过程进行深层次的思考，综合运用知识分析问题，对学生的思维能力、信息处理能力及表达能力有较好的锻炼。

5 结 语

随着素质教育的提出，以大型精密仪器为教学平台，结合科学研究热点内容，引入新技术新方法，不断优化教学内容，探索新的教学方法，已成为高校教学改革的趋势[13-15]。该类型设计性实验已在我院本科教学过程中顺利开展，取得了不错的教学效果。课程结合学院在药物化学方面的科研成果，以评价新化合物的临床前药理学研究为内容，更好地激发了学生的学习热情。通过引入液相、串联质谱、高速冷冻离心机等大型、精密分析仪器进行实验教学，不仅提高了大型仪器利用率，更拓展了学生视野，为培养高素质掌握现代分析技术的药学人才创造了条件[16]。通过实验方案设计、分析解决实验过程中遇到的问题，以及对结果的处理分析等环节的锻炼，切实提高了学生科研创新能力及解决制药工程实际问题的能力。