科研项目向本科化学综合实验项目转化的探索

王翎力, 金京一, 谢玉忠，2, 郑明花

(1.延边大学 化学国家级实验教学示范中心，吉林 延吉 133002；2.东北师范大学 化学学院，长春 130024)

0 引 言

2016年12月，教育部发布了《国家级实验教学示范中心管理办法》。文件明确指出，国家级实验教学示范中心是培养学生实践能力和创新精神的重要教学基地。它的建设与运行要服务于国家创新驱动发展战略，其目的在于提升大学创新人才培养能力,要求实验教学示范中心要不断有计划更新实验项目和内容，注重将科学前沿成果及时转化为实验教学项目，并确保综合性实验项目的适当比例。2018年年初，教育部进一步发布《化学类专业教学质量国家标准》，对综合实验做出了明确的界定，即实验内容至少跨2个以上化学二级学科，实验过程务必使学生接受相对系统的训练[1-2]。这2个文件的相继出台，对高校化学实验教学提出了更高的要求。

化学国家级实验教学中心通过多年的积极探索和广泛的同行交流，在反复的实践中逐渐形成了化学综合实验项目建设的一些经验。学校的化学综合实验项目主要来源于结合教师科研课题的本科毕业论文，科研实践及研究性实验、国家级大学生创新训练计划3部分。其共同特点是立足于学科发展前沿，以跨年级小团队探索为主，实验经费主要源于教师的科研项目，偶尔会涉及到昂贵的试剂和耗材。在科研成果向综合化学实验教学项目的具体转化过程中，实验主体发生了变化，由跨年级的合作团队变为本科生个体；实验目的发生了变化，从探索性研究变为相对系统性训练；实验经费受到了限制，实验场所发生了变化，从科研实验室变为本科教学实验室；相应的实验教学组织方式也会带来巨大的变化。

文章结合“吡啶-噁唑类荧光探针”实验，从科研课题向本科综合实验项目转移过程，促进科教融合，以激发学生的创新思维和创新意识为导向，实现相对系统培养学生实验动手能力和综合素质的目标[3-6]。

1 实验题目

荧光技术已发展成为分子生物学、细胞生物学、分析化学、环境检测和临床诊断的有力工具，也是目前化学学科的研究热点之一。小分子荧光探针可以选择性识别小分子、离子、酶等重要分析物种，其设计和使用涉及多学科，符合化学综合实验开设的基本要求。化学生物学科研创新团队长期致力与小分子荧光探针的研究，有系列的成果产出。但是，由于大多数的小分子荧光探针原料不易获得、合成相对耗时、实验过程中产生的污染较大，不适于转化为综合实验项目[7-13]。比如，团队成员开发的基于吡啶-噻唑结构单元(图1中PT)的小分子荧光探针，虽然结构简单、性能良好，但是在合成过程中不可避免使用劳伦斯试剂或五硫化二磷等试剂。在两轮的“专业综合实习”环节实践中，师生反馈的问题集中在合成过程中的刺激性气味，不适于作为综合实验项目在本科实验室推广。为解决此问题，团队成员进一步开发了吡啶-噁唑类荧光分子探针(图1中PO)，以“吡啶-噁唑类金属离子荧光探针”，解决了这个问题，并使之适于转化为本科的化学综合实验项目。

图1 吡啶-噻唑类(PT)和吡啶-噁唑类(PO)荧光探针的分子结构

2 实验目的

(1)了解过渡金属离子检测的意义，了解荧光探针的研究进展和研究意义，了解小分子荧光探针的主要设计原理。

(2)掌握噁唑环的构建方法，学会利用1H NMR等波谱手段对化合物进行结构表征。

(3)掌握荧光探针的基本表征方法，学会利用Origin等软件对相应数据进行拟合推导出配位常数和检测限。

(4)掌握利用以密度泛函方法(DFT)预测分子轨道，进一步挖掘实验内涵。

3 实验方案

(1)文献准备。实验前，学生需要提前学习教师提供的关于小分子荧光探针的综述性文献；在此基础上，利用中国知网、SciFinder等文献检索平台检索以下方面的内容：①噁唑类化合物的合成方法；②锌离子的检测意义及其荧光探针研究进展；③汞离子的检测意义及其荧光探针研究进展。

(2)合成。本实验包括两个吡啶-噁唑类化合物的合成，如图2所示。其中，两名同学各自分别合成5-苯基-2-(2-吡啶基)噁唑(PO-A)和4-苯基-2-(2-吡啶基)噁唑(PO-B)，并利用1H NMR谱图表征中间体1和目标产物PO的结构。

a.NH2CH(R1)CH(R2)OH,t-BuOH,K2CO3,I2,70 ℃;b.DDQ,CH2Cl2,rt.

(3)光谱测试。测定测试PO的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱，进而考查多种金属离子对PO分子荧光发射行为的影响，判断荧光探针对金属离子的选择性。以Job法确定PO与特定金属离子的配位比，在此基础上，结合荧光滴定实验采集的数据，通过Origin软件对数据进行拟合得到相应的络合常数和检测限。

(4)理论计算。利用Gaussian程序包，以DFT方法预测PO的分子轨道，分析荧光产生的原因，进一步讨论PO-A和PO-B两个结构高度类似的分子对不同金属离子产生特定响应的原因。

4 实验步骤

4.1 合成

化合物1的合成：10 mL叔丁醇中加入β-氨基乙醇(156.7 mg，1.16 mmol)和100 μL的2-吡啶甲醛(1.05 mmol)。室温下搅拌溶解后，向体系中分批加入500 mg的碘和440 mg的碳酸钾。加热升温，缓慢回流18 h后，加入亚硫酸钠水溶液终止反应。二氯甲烷萃取3次。有机相合并，饱和食盐水洗涤1次后，无水硫酸钠干燥。用旋转蒸发仪移除有机溶剂后，残余物以乙酸乙酯为洗脱剂快速柱层析，得到化合物1。采集化合物1A和1B的1H NMR数据，与文献对比，确认结构[14]。

化合物PO的合成：3 mL二氯甲烷中加入100 mg的化合物1(0.446 mmol)，搅拌至充分溶解后，加入125 mg的0.5 nm分子筛。室温下，向体系中分批加入DDQ(6×30 mg)。搅拌24 h后，加入15 mL的10 %氢氧化钠溶液停止反应。二氯甲烷萃取3次。有机相合并，饱和食盐水洗涤1次后，无水硫酸钠干燥。用旋转蒸发仪移除有机溶剂后，残余物以二氯甲烷为洗脱剂快速柱层析，得到化合物PO。采集化合物PO-A和PO-B的1H NMR数据，与文献对比，确认结构[15]。

4.2 光谱测试

PO的吸收和荧光光谱：分别测定PO-A和PO-B在乙腈溶液的吸收(10.0 μM)和荧光光谱(1.0 μM)，如图3。

图3 吡啶-噁唑类探针PO-A(实线)和PO-B(虚线)在乙腈溶液的吸收(黑色线)和荧光光谱(红色线)。其中，PO-A和PO-B的荧光光谱的激发波长分别为300 和330 nm。

多种金属离子对PO荧光光谱的影响：测定探针PO(1.0 μM)在不同种类的金属离子(10.0 eq)存在下的荧光光谱，如图4。从图4可以看出，只有Zn(II)离子能够使PO-A的荧光发射波长从399 nm红移至443 nm；只有Hg(II)离子能显著降低PO-B在403 nm处的荧光发射信号。因此，初步判定PO-A是Zn(II)的比率型荧光探针，PO-B是Hg(II)的“开-关”型荧光探针。

(a)

(b)

图4 金属离子对PO-A(a)和PO-B(b)的荧光光谱的作用。红色为探针PO的荧光光谱。

等摩尔系列法(Job法)：固定PO探针的浓度和待测金属离子浓度的总浓度([PO]+[M])为10.0 μmol/L，分别测定浓度为0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 μmol/L情况下的体系的吸收光谱。以Job法做图，可以确定PO-A和锌离子的配位比为1∶1，PO-B和汞离子的配位比为1∶1[13]。

荧光滴定实验：固定PO探针的浓度为1.0 μmol/L，分别测定不同当量的锌离子对PO-A荧光的影响和不同当量的汞离子对PO-B荧光的影响，得到图5(a)和图5(b)。

5 结果与讨论

5.1 探针与特定金属离子络合常数的拟合

测试体系中存在探针PO与金属离子的配位平衡。根据比尔定律，建立各个荧光发射峰的强度与对应物种浓度间的对应关系。如，对于探针PO-A来说，体系在443 nm处的荧光发射强度F对应于体系中与锌离子配位的PO-A(PO-A-Zn)的浓度，该波长处的最大荧光发射强度Fmax对应于体系中配合物PO-A-Zn的最大浓度。扣除体系在未引入锌离子时在443 nm处的荧光发射强度Fmin，可以推导出体系中未配位的PO-A的浓度(α)可以由(F-Fmin)/(Fmax-Fmin)来表示。PO-A与Zn(II)的络合常数Kas可以由下式表示[10]:

(a)

(b)

图5 (A)探针PO-A的锌离子荧光滴定图；(B)探针PO-B的汞离子荧光滴定图。

Kas=[PO-A-Zn]/([PO-A][Zn(II)])=

(1-α)/α[Zn(II)]

(1)

以log[Zn(II)]为横坐标，以(F-Fmin)/(Fmax-Fmin)为纵坐标，对荧光滴定数据进一步处理，得到图6(a)的星状数据。按式(1)，用最小二乘法进行拟合，得到PO-A与锌离子的络合常数为2.23×106(mol/L)-1，检测限为0.8 μmol/L。

按照相似的方法，对PO-B与汞离子的荧光滴定实验数据进行处理，拟合得到PO-B与汞离子的络合常数为0.548×106(mol/L)-1，检测限为2.2 μmol/L。

5.2 理论计算

利用Gaussian 09程序包，以DFT方法计算探针PO的分子轨道。在计算结果中，分别找到PO分子的能量最高占据轨道(HOMO)和能量最低未占据轨道(LUMO)，得到图7所示的结果。

对图7所示的电子云密度图进行分析讨论，可以得到以下推论：①两个探针分子的HOMO轨道电子云主要集中在苯环和噁唑环，LUMO轨道电子云集中在吡啶环和噁唑环；②探针分子PO的结构中，苯环可以认为是给电子基团(D)，噁唑环是桥(spacer)，吡啶是吸电子基团(A)。这种D-π-A结构是荧光分子的典型特征；③在光激发下，电子从HOMO到LUMO的跃迁时，电子云从HOMO轨道的富电子区域(苯环)向LUMO轨道的富电子区域(吡啶环)发生转移。这种分子内的电荷转移机制(ICT)正是探针PO分子的荧光起源[16]。

(a)

(b)

图7 探针分子PO-A和PO-B的HOMO和LUMO轨道的电子云密度图。B3LYP/6-31G(d，p)水平上由Gaussian 09预测。灰色：碳原子；蓝色：氮原子；红色：氧原子；出于图像简洁考虑，省略了氢原子。

学生可以进一步思考，只是苯基在噁唑环上的取代位置不同，为什么PO-A是锌离子的荧光探针，而PO-B是汞离子的荧光探针。

7 结 语

综合化学实验项目以吡啶-噁唑类荧光探针的研究为主线，涵盖了有机合成、仪器分析、计算化学等多个二级学科的相关内容，比较全面地训练了本科生的化学实验操作技能，综合性强。实验项目系统性地整合了实验教学和理论研究的内容，合理拓展了学生的理论研究能力，符合学生的研究能力的渐进培养的思路。实验所需仪器是化学实验室的必备仪器，试剂药品来源广泛。具有基础化学实验能力的本科生可以相对独立自主完成全部实验内容，可操作性强。同时,实验项目设置了具有高度开放性的思考题，鼓励学生进一步探索和思考现象背后的本质，有助于培养学生的创新思维。科研课题向本科综合实验项目的转移和固化过程中，需要考虑综合性、系统性、可操作性、开放性4个基本要素，如此才能实现系统培养学生实验动手能力和综合素质的目标，激发学生的创新思维和创新意识。