柱前衍生-超高效液相色谱法测定油莎豆饼粕中17种氨基酸的含量
2019-12-20陆雨顺赵丽娟宫瑞泽陈建波李志满孙印石
陆雨顺,赵丽娟,宫瑞泽,陈建波,李志满,孙印石
(中国农业科学院特产研究所,长春 130112)
油莎豆为莎草科(Cyperaceae)莎草属(Cyperus)油莎草种(Cyperus esculentus L.)1 年生植物(别名:油莎草、糖根果、地下板栗),原产于非洲及地中海沿岸国家,是我国近年来引进的一种优质、高产、综合利用前景广阔的经济作物[1-5]。其块茎油莎豆(Cyperus beans)产油量约为大豆4 倍、油菜的2 倍,是我国大力推广的新型油料作物,已被列入《全国种植业结构调整规划(2016-2020)年》推荐作物品种。它适应性极强,适宜在荒地、滩涂地及盐碱地等土地上种植[6]。
2018 年11 月22 日,科技部农村司在北京召开了油莎豆产业科技创新座谈会,讨论如何通过促进油莎豆产业发展来替代部分大豆产品,从而解决大豆进口比例过高的问题。目前,国内油莎豆饼粕主要用作饲料和肥料,产品附加值低、造成极大的浪费。国内针对油莎豆饼粕中氨基酸含量鲜见相关报道。本试验采用超高效液相色谱法(UPLC)同时检测油莎豆饼粕中17种氨基酸的含量,为进一步挖掘油莎豆在食品、饮料、医学等方面的应用价值提供理论依据。
1 材料
1.1 试验材料
油莎豆,采购自吉林省吉林市农贸市场,经吉林农业大学李伟教授鉴定为莎草科植物油莎草(C.sculentusL.)的块茎。
1.2 试验试剂
盐酸(分析纯,北京化工厂);乙腈(色谱纯,美国Fisher 公司);AccQ·Tag 氨基酸试剂包(包括氨基酸专用衍生剂 AccQ Fluor Buffer、AccQ Tag Eluent A 溶液(0169190771)、硼酸盐缓冲液、17 种氨基酸混合标准液(组氨酸、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸,除半胱氨酸浓度为1.25mol/mL 外,其余氨基酸浓度均为2.50mol/mL)(美国 Waters 公司)。
1.3 试验仪器
ACQUITY H-Class超高效液相色谱仪(美国Waters 公司);MS204S 电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司);TGL-16G高速离心机(上海安亭科学仪器厂);Milli-Q Advantage A10 超纯水器(美国密理博公司);JP-100ST超声仪(广州市洁盟超声波清洗设备有限公司);XW-80A 微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)。
2 方法与结果
2.1 标准溶液的配制
以17 种氨基酸混合标准液为母液,用超纯水配制成浓度分别为 25、50、250、500、1 250mol/L的混合氨基酸标准溶液。
2.2 供试样品溶液的制备
油莎豆饼粕的制备按文献方法[7],将干燥后的油莎豆粉碎,过20~40 目筛,采用正己烷60 ℃恒温水浴锅中回流提取2 次,每次9 h,抽滤得到萃取液及固形物,将固形物室温脱溶制得油莎豆饼粕。按文献方法[8],准确称取饼粕样品粉末0.50 g,置于30 mL水解管中,加入6 mol/L 盐酸20 mL,涡旋混匀后,置于110 ℃水解24 h,水解完全后冷却至室温,取800L 上清液于试管中,80℃加热挥干溶剂,加入2 mL 超纯水复溶,涡旋30 s,使其充分溶解。采用0.22m 滤膜过滤样品至进样瓶,待衍生化。
2.3 衍生化反应
2.4 色谱条件
AccQ-TagUltraC18 色谱柱:100mm 2.1mm,1.7m;柱温:49 ℃;流动相:A 为 AccQTag Eluent A 溶液,B为10%乙腈水,C为水,D为乙腈;梯度洗脱程序:见表1;进样体积:1L;检测波长:260 nm。17 种氨基酸对照品和饼粕样品色谱图见图1。
图1 17 种氨基酸标准品(A)及油莎豆饼粕样品(B)的UPLC图Fig.1 UPLC of 17 amino acid standards(A)and soybean meal of Cyperus Beans samples(B)
表1流动相梯度洗脱程序Table1 Mobile phase gradient elution procedure
2.5 方法学考察
2.5.1 线性范围、检出限和定量限 配制的系列浓度混合氨基酸标准溶液衍生后进样测定,以氨基酸溶液浓度X(mol/L)为横坐标、峰面积Y 为纵坐标,绘制17 种氨基酸回归方程,结果见表2。从表2 可以看出,17 种氨基酸在25~1 250mol/L 线性关系良好,决定系数R2为0.942~0.997。以3 倍信噪比(S/N=3)计算检出限(LOD),以10 倍信噪比计算定量限(LOQ),结果见表2。
表2 17 种氨基酸的回归方程、决定系数(R2)、检出限和定量限Table 2 Regression equations,determination coefficients(R2),LOD and LOQ for determination of 17 amino acids
2.5.3 重复性试验 准确称取0.5 g 油莎豆饼粕样品3 份,按“2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.4”项下色谱条件上机测试,对各成分峰面积积分,得17 种氨基酸RSD 为0.10%~4.77%,表明样品的重复性良好。
2.5.4 稳定性试验 精密吸取“2.2”项下同一样品供试品溶液1L,分别在 0、2、4、8、16、24 h 按“2.4”项下色谱条件进样分析,测定峰面积。结果发现,17 种氨基酸的RSD 为1.84%~2.13%,表明该试验在24 h 内稳定性良好。
2.5.5 加样回收试验 精密称取9 份已知氨基酸含量的饼粕样品粉末0.3 g,按低、中、高剂量加入适量的17种氨基酸标准品,按“2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.4”项下色谱条件测定峰面积计算含量,计算氨基酸回收率。结果发现,17 种氨基酸平均加样回收率为98.22%~100.01%,RSD 为1.70%~2.44%,表明加样回收率良好。
2.6 油莎豆饼粕中氨基酸含量检测
油莎豆饼粕样品中氨基酸含量采用外标法定量,具体含量见表3。从表3 可以看出,油莎豆饼粕中富含参与蛋白质合成的17 种氨基酸,总量为95.7 g/kg,其中,精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸是最主要的3 种氨基酸,分别占总氨基酸的31.02%、15.92%和16.93%;半胱氨酸为油莎豆中的第1 限制性氨基酸,在饼粕中未检出;8 种人体必需氨基酸(甲硫氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸、苏氨酸、赖氨酸)总量为14.4 g/kg,占总氨基酸的15.04%,其中,赖氨酸和异亮氨酸占总氨基酸4.4%和3.8%,最接近FAO/WHO 模式谱参考值;呈味氨基酸总量为88.1 g/kg,占总氨基酸的92.06%,其中,鲜味氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸)、甜味氨基酸(丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸)和苦味氨基酸(组氨酸、精氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸)含量分别为32.9、10.0 和45.2g/kg。以上氨基酸分析结果表明,油莎豆饼粕营养价值较高。
表3 油莎豆饼粕中氨基酸含量Table 3 Amino acid content of soybean meal of cyperus beans samples (g/kg)
3 结论与讨论
本试验采用酸水解法将油莎豆饼粕水解后,通过柱前衍生高效液相色谱法测定17 种氨基酸成分,并进行一系列方法学评价。结果表明,该方法简便、重复性好、精密度高,可用于油莎豆饼粕中氨基酸的含量测定。
氨基酸是生物有机体的重要组成部分,在生命现象中起着至关重要的作用。对饼粕中的氨基酸成分进行分析是开发油莎豆饼粕的基础工作之一。通过对油莎豆饼粕中氨基酸含量分析发现,油莎豆饼粕中氨基酸以精氨酸含量最高,其次是天冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸含量,分别占总氨基酸的32.5%、16.7%、17.8%、4.4%;油莎豆饼粕中富含人体所需的必需氨基酸,占总氨基酸含量的15.0%。此外,根据Rotzoll 等[9]对氨基酸滋味特征的描述,鲜味氨基酸天冬氨酸和谷氨酸在油莎豆饼粕中含量均较高,占总氨基酸的34.32%,保证了饼粕鲜美的口感;但缬氨酸、亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、异亮氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸8 种苦味氨基酸含量占到总氨基酸的47.23%,会影响饼粕的口味,是后续开发产品需要着重关注的问题。本研究为后续油莎豆饼粕产品的精深开发提供了理论基础。