温州地区耳聋患者SLC26A4基因突变分析

白文静 潘勇 吴丽芳 项延包

耳聋是我国高发的出生缺陷疾病之一，在新生儿中的发病率为1‰～3‰，其致病因素包括环境和遗传两大类，其中遗传因素占50%以上[1-3]。我国耳聋患者最常见的致聋基因为 GJB2、SLC26A4、GJB3及线粒体 12S rRNA等4种，其中SLC26A4基因在耳聋患者中的突变检出率为5%～15%[4-7]。迄今已报道SLC26A4基因致病突变 460余种（http://deafnessvariationdatabase.org/）。由于该基因较大（包含21个外显子）且具有很强的遗传异质性，常表现为不同耳聋群体具有不同的突变图谱。因此，通过检测与分析不同地区耳聋群体的SLC26A4基因突变，以寻找不同群体的突变热点，进而调整不同耳聋群体的检测策略。本研究采用Sanger测序技术检测187例非综合征型耳聋患者的SLC26A4基因突变情况，以探讨温州地区耳聋患者的SLC26A4基因突变检出率及基因突变图谱。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2011年1月至2017年12月在本院门诊就诊的187例耳聋患者临床资料及外周血样本。其中男108例，女79例；均以听力损失为唯一临床表型；临床诊断均为非综合征型双耳感音神经性耳聋，听力分别为轻度（听力阈值＞25～40dB）至极重度（听力阈值＞90 dB）听损不等。

1.2 方法 采用QIAGEN公司QIAamp DNA Mini Kit抽提试剂盒，抽提耳聋患者外周血DNA；各取2μl DNA样本，使用紫外分光光度计分别进行定量和纯度检测。参考相关文献[8-9]，对SLC26A4基因第7、8、19外显子及其与内含子交界处的50bp进行PCR扩增及测序检测，若上述片段范围内检出纯合或复合杂合双等位基因突变以及未检出任何突变，则进入结果统计；若上述片段范围内仅检出单个位点杂合突变，则对SLC26A4基因剩余外显子进行PCR扩增及Sanger测序分析。测序过程如下：先通过PCR扩增并将PCR扩增产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析确认，PCR产物于SAP酶混合液中纯化，再行Cycle测序反应。反应产物通过NaAc-乙醇法进行纯化，并在ABI3130 DNA全自动测序仪上进行测序。

1.3 统计学处理 应用DNAstar软件读取测序数据，并用SeqMan软件将所测序列与NCBI中的基因标准序列进行比对分析，记录序列比对结果。

2 结果

187例耳聋患者中有22例患者检出SLC26A4基因突变，占11.76%；其中SLC26A4杂合突变4例（2.13%），纯合或复合杂合突变18例（9.63%）。22例患者共检出11种SLC26A4基因分型，包括5例c.919-2A＞G/c.2168A＞G、4例 c.919-2A＞G杂合突变、4例 c.919-2A＞G纯合突变、2例c.919-2A＞G/c.416-1G＞A、1例c.919-2A＞G/c.946G＞T、1例 c.919-2A＞G/c.1229C＞T、1例 c.919-2A＞G/c.1607A＞G、1例 c.919-2A＞G/c.1707+5G＞A、1例 c.919-2A＞G/c.1975G＞C、1例 c.919-2A＞G/c.2167C＞G、1例 c.2168A＞G/c.281C＞T，见表1。

22例基因突变患者共检出SLC26A4基因10种40次突变，其中c.919-2A＞G检出率最高，占总等位基因的6.68%（25/374）；c.2168A＞G突变6次，占总等位基因的1.60%（6/374）；c.416-1G＞A突变2次，占总等位基因的 0.53%（2/374）；c.281C＞T、c.946G＞T、c.1229C＞T、c.1607A＞G、c.1707+5G＞A、c.1975G＞C、c.2167C＞G各突变1次，分别占总等位基因的0.27%（1/374），见表2。

3 讨论

本研究结果显示，温州地区187例非综合性型耳聋患者共检出22例存在SLC26A4基因突变，占11.76%，其中9.63%存在双等位基因突变，这与我国其他地区报道的5%～15%的基因突变检出率相近[5，10-11]。在等位基因突变频率中，c.919-2A＞G、c.2168A＞G所占比例最高，是温州地区非综合征耳聋患者SLC26A4基因突变最主要的类型，与我国其他地区报道结果亦相同[5，10-11]。SLC26A4基因是常染色体隐性遗传，但全编码区测序范围内检测仍有4例为单位点杂合突变患者，推测可能存在基因上游调控区的未知点突变或是拷贝数变异导致复合杂合致病，亦或是该类个体仅单纯的为人群基因杂合突变携带者[5，12]。

表1 SLC26A4基因突变患者基因分型（n=187）

表2 SLC26A4基因突变及其频率（n=374）

22例基因突变患者共检出10种致病突变，其中c.281C＞T、c.1229C＞T、c.1607A＞G、c.1975G＞C、c.2167C＞G以及c.2168A＞G为错义突变，分别导致SLC26A4基因编码蛋白第 94、410、536、659、723、723 位点发生氨基酸替换；c.946G＞T为无义突变，导致编码蛋白发生提前终止而截短；c.416-1G＞A、c.919-2A＞G、c.1707+5G＞A为剪接突变，导致编码蛋白的外显子拼接发生剪接错误；上述突变均致使SLC26A4基因编码产生非正常功能的PDS蛋白，使内耳胞间离子交换受阻，最终导致耳聋临床表型的发生[13-16]。除了高检出率的c.919-2A＞G与c.2168A＞G突变外，其余8种罕见突变分别位于基因不同的外显子或内含子上，这表明对检出存在热点位点杂合突变的耳聋患者应对剩余所有的外显子及与内含子交界处片段的位点进行突变检测，进而提高SLC26A4基因突变检出率。

综上所述，SLC26A4基因是温州地区非综合型耳聋患者的主要致聋基因之一，c.919-2A＞G、c.2168A＞G是该地区SLC26A4基因突变最主要的类型，与我国其他地区耳聋群体数据相似。此外，本研究同时检出了多种热点以外的罕见突变，丰富了温州地区耳聋患者的遗传突变图谱，为本地区耳聋患者的基因诊断和遗传咨询提供了数据基础和遗传学理论指导。