山奈素对大鼠动脉性勃起功能障碍治疗作用的机制研究

孟 宇 ，王李卓 ，陈靠山

勃起功能障碍（Erectile Dysfunction，ED）是男性的常见病和多发病，正常的血管和细胞功能是维持阴茎勃起的基础，若血管发生病变则导致ED疾病的发生，占到ED病的50%［1］.神经递质NO和NOS存在于多种细胞和组织中，作为阴茎海绵体勃起和松弛的主要神经递质，目前比较统一认可的观点是通过NO-cGMP这个信号传导通路来调节阴茎组织对性刺激的反应，即勃起和舒张［2］，所以，NO和NOS在勃起功能中的作用至关重要［3］.ED病治疗方法多是药物性治疗为主，其副作用大而且价格昂贵［4］.本实验室已从牛蒡根中分离出黄酮类化学物质山奈素［5］，初步实验证实牛蒡根成分牛蒡低聚果糖和山奈素具有治疗ED病的作用［5-7］.其机制尚不清楚，本文检测阴茎组织中NO含量和NOS的活性，以及阴茎和睾丸组织中NOSmRNA的表达情况，来探讨其治疗效果的可能机制.

1 材料

1.1 实验动物

雄性SD大鼠48只，6～7周龄，体重（180±20）g，由皖南医学院动物房提供，饲养于清洁、适温的房间，正常饮食.

1.2 药品试剂

山奈素由牛蒡根水提取中提取纯化，NO检测试剂盒（KGT00725）；NOS检测试剂盒（KGT020）；Trizol总RNA提取试剂（KGA1203），RT-PCR试剂盒（KGA1303），均购置于南京凯基生物科技发展有限公司.

2 实验方法

2.1 NO含量和NOS活性的测定

大鼠于灌胃处理2 h后给予2%戊巴比妥钠2 mL腹腔注射麻醉，取出阴茎和睾丸组织，加入生理盐水，冰浴进行操作，研磨匀浆，按测定试剂盒说明书进行操作.

2.2 动物分组及模型构建

将雄性SD大鼠48只随机分成6组：假手术组、模型组、山奈素50 mg·kg-1组和山奈素100 mg·kg-1组，进行髂内动脉结扎给动物造模型，其中假手术组也需要进行手术开腹，但无需结扎动脉.模型成功后各个组给予每天一次用药，连续用药3周.

2.3 RNA的提取及纯度的鉴定

阴茎和睾丸组织的处理：手术取出组织80 mg，按试剂盒的说明提取RNA.按照1 mL Trizol试剂加入1 mL 75%的乙醇的比例；其沉淀不可太干燥，以免后期不好溶解.最后加入50 μL DEPC处理过的水溶解RNA沉淀，待完全溶解后立即置于冰上或于-70℃保存.按公式来计算浓度，RNA的浓度=OD260×稀释倍数×0.04 μg·μL-1，OD260/280在1.8～2.1范围内可认为RNA纯度高.

2.4 RT-PCR反应的操作步骤

（1）RT反应.使用前对每个组进行混匀，动作要轻，低速离心20 s；在无核酸酶的PCR管中加入相应体积的各个组份.70℃保温10 min，然后冰浴5 min；往0.2 mL PCR管依次加入下列组份：RNase抑制剂（40 u/μL），Buffer，dNTPs，DTT（1M），逆转录酶，无核酸酶的双蒸水；混匀后，低速2000 rpm离心20 s；继而在42℃保温1 h，然后70℃保温15 min；其产物可以保存在-20℃冰箱或者用于下步反应.

（2）PCR反应.①冰浴上进行操作，事先准备好无菌、无核酸酶的0.2 mL离心管，在离心管中依次加入相应的各个组份，最后灭菌双蒸水至总体积50 μL.轻轻混匀，低速2 000 rpm离心20 s后进行PCR扩增；反应结束后，取5 μL扩增产物，用琼脂糖凝胶电泳的方法来鉴定反应产物.②PCR扩增条件.nNOS：变性：95℃*30 sec，退火：55 ℃*30 sec，延伸：72 ℃*35 sec；32个循环；iNOS：变性：95 ℃*30 sec，退火：55℃*30 sec，延伸：72 ℃*35 sec；32个循环；eNOS：变性：95 ℃*30 sec，退火：55℃*30 sec，延伸：72℃*35 sec；32个循环.

3 结果

3.1 山奈素对A-ED大鼠阴茎组织中NO含量和NOS活性的影响

山奈素对A-ED大鼠阴茎组织中NO含量和NOS活性的影响如表1所示.

由表1可知，给予山奈素100 mg·kg-1组与模型组相比较，阴茎组织中NO含量和NOS的活性显著提高（p＜0.01），山奈素50 mg·kg-1组与模型组比较，能明显提高阴茎组织中NO和NOS的含量（p＜0.05）.结果说明山柰素可以提高阴茎组织中NO含量及NOS的活性.其中假手术组作为阴性对照组，说明模型建立成功.

表1 山奈素对A-ED大鼠阴茎组织NO含量和NOS活性的影响

3.2 山奈素对A-ED大鼠阴茎组织中3种NOS亚型基因表达水平的影响

山奈素对A-ED大鼠阴茎组织中3种NOS亚型基因表达水平的影响结果如表2所示.

表2 山奈素对大鼠阴茎组织中3种NOS亚型基因表达的影响

从表2可以看出，给予山奈素灌胃处理后，山奈素100 mg·kg-1组与模型组大鼠比较，能显著增加eNOS和nNOS基因的表达，对iNOS基因的表达也有一定的上调作用.山奈素50 mg·kg-1组与模型组大鼠比较，能明显增加各组NOS的基因表达；说明山奈素对阴茎组织中NOS的基因表达有上调作用.

3.3 山奈素对A-ED大鼠睾丸组织中3种NOS亚型基因表达水平的影响

给予山奈素灌胃处理后，山奈素对A-ED大鼠睾丸组织中3种NOS亚型基因表达水平均有不同程度的影响，结果见表3.

表3 山奈素对A-ED大鼠睾丸组织中3种NOS亚型基因表达水平的影响（xˉ±s）

图1 山奈素对A-ED大鼠睾丸和阴茎组织3种亚型NOS表达的电泳图

从表3可以看出，山奈素50 mg·kg-1能明显提高A-ED大鼠睾丸组织中nNOS和eNOS基因的表达水平，100 mg·kg-1能够显著提高nNOS和eNOS基因的表达.因此，山奈素能够增加睾丸组织中nNOS和eNOS的基因表达，电泳图见图1.

4 讨论

勃起功能障碍作为男性的一种常见和多发疾病，严重影响身心的健康.此病有多种类型和病因，阴茎动脉供血不足，是导致本病发生的一个重要多见原因［8］.EL-SAKKA等［9］通过结扎双侧髂内动脉的方法制作了大鼠血管性ED模型，研究证实NOS的表达水平和活性的变化与A-ED的发病机制有关.对于阴茎勃起的信号通路，目前比较统一的观点NO是通过NO-cGMP这个信号传导通路来调节阴茎组织对性刺激的反应，阴茎副交感神经、非肾上腺素、非乙酰胆碱能神经末梢、阴茎海绵体血管内皮细胞内的一氧化氮合酶（NOS）将精氨酸催化成一氧化氮（NO）［10］，从而使阴茎组织进行舒张勃起.NOS包括神经型（nNOS）、内皮型（eNOS）和诱导型（iNOS）3种类型.nNOS主要存在于中枢神经系统及周围神经系统中，在神经组织内产生一氧化氮，协助细胞间的信号传导.eNOS于血管内产生一氧化氮，可以协助调节血管功能.iNOS主要利用一氧化氮的氧化应激作用，协助巨噬细胞在免疫系统中对抗病原体.nNOS和eNOS是参与阴茎勃起的重要物质，也与实验结果吻合.结扎血管可以导致阴茎海绵体的缺血缺氧，当机体受到性刺激后，缺血缺氧导致海绵体结构和功能损伤，降低了NOS 3个亚型的表达，NO产生减少，NO信号功能减弱，海绵体平滑肌舒张功能减弱而导致ED病的发生［11-13］.本实验根据De young等的方法，结扎大鼠髂内动脉，建立模型组，通过数据可以知道，ED模型组的3种一氧化氮合酶亚型基因表达明显降低，证明该模型可以作为血管性ED模型开展实验，进行下一步的研究工作.经过三周不同剂量的山奈素灌胃给药后，能够明显地提高A-ED大鼠阴茎组织NOS的活性，使得NO含量增加，给药组对NOSmRNA的基因表达也有明显提高.

实验结果表明，其机制可能是NOS的活性提高使NO的含量增加，NO-cGMP信号通路被激活，从而改善ED的症状.前期实验证实牛蒡根水提取具有治疗ED病的作用［7］，且对阴茎海绵体平滑肌细胞进行原代培养可行［14］，后期将从阴茎海绵体平滑肌和分子信号通路等方面继续进行研究ED病的治疗方法机制.