鱼腥草中总黄酮的提取工艺优化研究

刘浩 唐红枫

摘要：以鱼腥草（Houttuynia cordata Thunb.）总黄酮提取率为考察指标，以芦丁为对照品，在单因素试验的基础上，采用正交设计对乙醇体积分数、料液比、提取温度及提取时间4因素进行优选。结果表明，将鱼腥草粉末与70%乙醇溶液进行1∶25混合，置于70 ℃恒温水浴箱中浸提90 min，此条件下鱼腥草总黄酮提取率为3.640%，为优化鱼腥草中总黄酮的提取工艺提供了参考依据。

关键词：鱼腥草（Houttuynia cordata Thunb.）;总黄酮;工艺优化;正交设计

中图分类号：R284.2         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）21-0155-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.21.033

Abstract： The extraction medium was selected，the extraction rate of total flavonoids from Houttuynia cordata was taken as the index， and rutin was taken as the reference substance. On the basis of single factor test， four factors such as ethanol concentration， liquid-liquid ratio， extraction temperature and extraction time were optimized by orthogonal design. The results showed that the optimal solution for extracting total flavonoids from Houttuynia cordata by ethanol extraction method was as follows： Houttuynia cordata powder was mixed with 75% ethanol solution in a ratio of 1∶25 and placed in a constant temperature water bath at 70 ℃ for 90 min， the total flavonoid extraction rate of Houttuynia cordata was 3.640%. This experiment provides a reference for optimizing the extraction process of total flavonoids from Houttuynia cordata.

Key words： Houttuynia cordata Thunb.; total flavonoids; optimization of procedure; orthogonal design

鱼腥草（Houttuynia cordata Thunb.）干燥的地上叶茎是一味被收录于《中国药典》的草药。鱼腥草主要分布在亚洲东部、东南部，因其喜湿怕旱，通常会在背阴山坡、河畔田埂等土壤潮湿处蔓延生长[1]。鱼腥草味辛性寒，入肺经。有清热解毒、利尿消肿、健胃消食之效[2，3]，能治疟疾、肺炎、湿疹等病症，还能增强机体免疫力。鱼腥草主要有蕺菜碱、芸香甙、金丝桃甙、槲皮甙等黄酮类化合物[4-6]，它们是鱼腥草水溶性成分中重要药用组成部分，其药理作用有降血糖、降血脂、抗氧化、清热解毒等[7]。在抗氧化剂中，黄酮类化合物较常见[8]，如芦丁、槲皮素等能够增强心脏的收缩;杜鹃素能够镇咳祛痰;黄芩苷能够解热镇痛;水飞蓟素能够保肝凝血等[9，10]。

鱼腥草中黄酮类化合物具有广泛的药用保健价值[11]，但目前黃酮类化合物的提取效率并不高。本研究对影响提取效率的4因素（乙醇体积分数、料液比、提取温度、提取时间）设计正交试验，得出乙醇提取鱼腥草中总黄酮的最优方案。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  材料  鲜鱼腥草，由武汉东湖学院中草药研发试验基地提供。

1.1.2  仪器  电鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司;中草药粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司;数显恒温搅拌循环水箱，常州国华电器有限公司;紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司;电子分析天平，上海台衡仪器仪表有限公司;UV-1800型紫外分光光度计，日本岛津公司。

1.1.3  试剂  芦丁标准品，UV≥98%，购于上海金穗生物科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2  方法

1.2.1  材料的制备  采摘新鲜鱼腥草根茎，自来水洗去泥沙灰尘，将鱼腥草茎切成1 cm小段，浸泡于蒸馏水中，漂洗3次，将水沥干，用洁净的纱布包裹放入40 ℃烘箱中干燥至恒重后在中草药粉碎机中研磨2次，5 min/次，过40目筛，收集过筛后的鱼腥草粉末，置于密封袋中于阴凉干燥处保存备用。

1.2.2  芦丁标准曲线的绘制及提取溶剂的选择  芦丁标准曲线绘制和鱼腥草样品粗提液的制备按照文献[12，13]方法进行。将5份1.000 g 鱼腥草粉末分别加入到不同溶剂（石油醚、纯水、丙酮、70%乙醇、乙酸乙酯）中，用保鲜膜封口，60 ℃恒温水浴30 min。然后逐一抽滤并收集滤液，将滤液用70%乙醇溶液在室温下定容至50 mL，放置15 min，测A510 nm，根据芦丁标准曲线计算出鱼腥草根中总黄酮的提取率Q，确定最佳提取溶剂，计算公式如下：

Q=[（c×V×n）/（m×103）]×100%

式中，c为回归方程算得鱼腥草茎中总黄酮的浓度，mg/mL;V为粗提液定容体积，mL;n为粗提液稀释倍數;m为鱼腥草粉末质量，g。

1.2.3  单因素试验

1）浸提介质浓度。将5份1.000 g鱼腥草粉末分别加入到30.00 mL不同体积分数的已确定的最佳提取溶剂（40%、50%、60%、70%、80%）中，用保鲜膜封口，然后按“1.2.2”中粗提液的制备及提取率计算处理。

2）料液比。根据最佳提取溶剂及浓度，将5份1.000 g鱼腥草粉末分别加入到不同料液比（g/mL，1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）烧杯中，用保鲜膜封口，然后按“1.2.2”中粗提液的制备及提取率计算处理。

3）提取温度。根据最佳提取溶剂、浸提介质浓度和最佳料液比结果，将5份1.000 g鱼腥草粉末分别加入到相应溶液中，用保鲜膜封口，分别放在40、50、60、70、80 ℃的恒温水浴箱中浸提30 min，然后按“1.2.2”中粗提液的制备及提取率计算处理。

4）提取时间。根据最佳提取溶剂、浸提介质浓度和最佳料液比结果，将5份1.000 g鱼腥草粉末分别加入到对应溶液中，用保鲜膜封口，在最佳提取温度下恒温水浴30、60、90、120、150 min，并收集滤液，然后按“1.2.2”中粗提液的制备及提取率计算处理。

1.2.4  正交试验  在综合单因素试验的基础上，采用L9（34）设计了四因素三水平正交试验，因素与水平见表1。

2  结果与分析

2.1  最大吸收波长的确定

经400～600 nm扫描检测得到芦丁标准品溶液的吸收波长曲线，截取450～550 nm曲线如图1。由图1可知，鱼腥草中总黄酮的最大吸收波长为510 nm，故将510 nm作为测定鱼腥草中总黄酮含量的吸收波长。

2.2  芦丁溶液浓度标准曲线

以芦丁质量浓度c（mg/mL）为横坐标，以A510 nm为纵坐标，绘制芦丁浓度标准曲线如图2。

2.3  提取溶剂的选择

以石油醚、纯水、丙酮、70%乙醇、乙酸乙酯为浸提介质[14]，样品溶液的总黄酮提取率如图3。由图3可知，提取率最高的浸提介质是70%乙醇，其总黄酮提取率为3.088%，故将70%乙醇作为最佳浸提介质。

2.4  单因素试验结果

2.4.1  乙醇体积分数  选用不同体积分数的乙醇溶液为浸提介质提取总黄酮试验结果见图4。由图4可知，鱼腥草中总黄酮的提取率随乙醇体积分数的升高而增加，当乙醇体积分数达70%时，提取率达到最高，但继续加大体积分数后，提取率反而下降，可能原因是乙醇体积分数过高导致一些植物组织中醇溶性杂质、亲脂性成分及色素溶解增多，与黄酮类化合物形成竞争，从而使总黄酮提取率下降。由于植物中总黄酮一部分易溶于水，大部分易溶于有机溶剂，故70%乙醇溶液符合预期推测。

2.4.2  料液比  由图5可知，随着提取溶剂的增大，鱼腥草中总黄酮的提取率增加。当溶剂较少时，样品未能与乙醇溶液充分接触，使得有效成分浸出不完全，但溶剂的增加使后续浓缩时间增长，且当样品溶解达到饱和状态后会引起不必要的溶剂消耗。当料液比1∶30时，样液中总黄酮的提取率最高，为3.092%。但是料液比为1∶25时，总黄酮提取率为3.079%。考虑到工业生产成本，料液比1∶30相对于1∶25增效十分有限，故将1∶25作为最佳料液比。

2.4.3  提取温度  将1∶25料液比体系的70%乙醇溶液和鱼腥草粉末置于5个不同温度下水浴浸提30 min，总黄酮提取率见图6。由图6可知，提取温度低于70 ℃，鱼腥草中总黄酮提取率随温度升高而显著增加，因为分子运动速率加大。但温度高于70 ℃后，提取率升高缓慢，因为黄酮类化合物具有多个苯环和酚羟基，在高温条件下其化学性质活泼、易发生氧化反应与缩合反应。当温度为80 ℃时，鱼腥草中总黄酮的提取率最高，为3.326%;温度为70 ℃时，总黄酮提取率为3.273%。温度过高不仅造成乙醇挥发速度加快，而且导致样品中活性成分的湿热降解或异构化，使得黄酮有效成分减少。从节能减排以及高温对提取物稳定性的影响方面考虑，将70 ℃作为最佳提取温度。

2.4.4  提取时间  以70%乙醇为浸提介质、1∶25料液比、70 ℃水浴浸提，探究最佳的水浴时间对总黄酮提取率的影响（图7）。由图7可知，鱼腥草中总黄酮提取率随提取时间增长而增加，但速率逐渐减缓，一方面是浸提步骤接近完成，另一方面因长时间受热使得部分游离黄酮被氧化分解，且提取溶剂挥发较多。当浸提水浴时间150 min时，鱼腥草中总黄酮提取率最高，为3.740%。但是90～150 min总黄酮提取率只提高了0.101个百分点。结合工业生产成本考虑，以及长时间高温环境对物质稳定性的影响，将90 min作为最佳提取时间。

2.5  正交试验结果

由乙醇浸提法提取鱼腥草总黄酮的正交试验结果（表2）可知，以上4种因素的极差依次为D>B>A>C，因此影响鱼腥草中总黄酮提取率的因素排序为浸提时间>料液比>乙醇体积分数>浸提温度，所得最佳组合条件为A2B2C2D2，即乙醇体积分数70%，料液比1∶25，水浴温度70 ℃，浸提时间90 min。

2.6  验证试验

按最优条件进行3组平行试验，结果见表3。3次鱼腥草总黄酮提取率依次为3.652%、3.626%、3.643%，平均值3.640%，表明最优组合优化方案可行。