水稻低节位早发分蘖与秧苗叶片形态、碳氮代谢的关系

涂雯 安琪 何永刚 刘少佳 蔡海亚 章志宏

摘要：為了研究水稻（Oryza sativa L.）低节位早发分蘖与叶片形态、碳氮代谢之间的关系，并筛选低节位分蘖多、早期分蘖发生速率快且符合理想株型叶片形态的水稻品种（系），对31个籼亚种水稻品种（系）早期低节位的分蘖特性、叶片形态及碳氮代谢指标进行了相关性分析和聚类分析。结果表明，在正常栽培条件下，不同水稻品种（系）第一叶位成蘖率存在广泛变异，而第二、第三叶位成蘖率达到100%;水稻低节位分蘖发生速率与秧苗前3片叶叶长呈正相关，分蘖数量与叶宽呈负相关，因此，在育种上，可以将水稻秧苗前3片叶较长且较窄作为筛选早发分蘖水稻品种的参考形态指标;水稻植株体内蔗糖含量只影响分蘖发生速率，但不影响分蘖数量;硝态氮含量既影响分蘖发生速率，也影响成蘖率，氮代谢酶谷氨酸合酶（NADH-GOGAT）和谷氨酸脱氢酶（NADH-GDH）的活性能促进水稻低节位分蘖的发生;将31份水稻品种（系）进行聚类，可分为A、B、C 3类，其中C类材料是分蘖发生较早且分蘖发生速率快、叶片形态更接近于理想株型叶片形态的优质育种材料。

关键词：水稻（Oryza sativa L.）;低节位分蘖;分蘖早发;叶片形态;碳氮代谢

中图分类号：S511         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）21-0022-08

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.21.004

Abstract： In order to study early tillers at low-nodes and their association with leaf morphological characters and carbon and nitrogen metabolism， and to screen rice （Oryza sativa L.） varieties （lines） with many tillers at early low-nodes， high tillering rate and the leaf morphology of ideal plant architecture， the tillering characteristics at early low-nodes， seeding leaf morphology and carbon and nitrogen metabolism indexes in 31 indica rice varieties （lines） were studied by correlation analysis and cluster analysis. The results showed that under general cultivation conditions， the tillering rate of the first node in different rice varieties （lines） showed extensive variation， while the tillering rate of the second and third node reached 100%. The occurrence rate of tillers at low-nodes in rice was positively correlated with seeding leaf length， and tiller number was negatively correlated with leaf width. Therefore， in breeding， the first three leaves of rice seedlings which are longer and narrower can be used as morphological reference indexs for selecting rice varieties with early tillers. The sucrose content in rice seeding affected only the occurrence rate of tillers， but not affected tiller number. Nitrate content affected not only the occurrence rate of tillers， but also the tillering rate. The activity of nitrogen metabolic enzymes such as glutamate synthase （NADG-GOGAT） and glutamate dehydrogenase （NADG-GDH） could promote the formation of tillers at low-nodes in rice. The rice varieties（lines） investigated in the current study were clustered into three categories： classes A， B and C. Among them， materials in class C were high-quality breeding materials with early tillers， fast occurrence rate of tiller， and leaf morphology closer to that of ideal plant architecture.

Key words： rice （Oryza sativa L.）; low-node tillers; early tillers; leaf morphological characters; carbon and nitrogen metabolism

水稻（Oryza sativa L.）叶片形态与光合作用密切相关，作为植株的“源”器官，为植株的的生长发育提供必需的营养。水稻分蘖芽的伸长也需要母茎叶片为其提供养分才得以形成分蘖，而且对水稻产量的最终形成影响也较大[1，2]。碳氮代谢是植物最基本的物质和能量代谢，影响并决定植物光合产物的分配与利用、蛋白质的合成、矿物质的吸收等多种生命活动。其中，碳代谢为氮代谢提供碳骨架和能量，而氮代谢又为碳代谢提供必需的酶类;同时碳、氮代谢还需要相同的还原力、ATP和碳骨架[3，4]。二者相辅相成，相互合作又相互竞争，这两者的协调程度不仅直接关系到植物正常的生长发育，也在很大程度上影响植物分枝的发生与生长。

近年来，在小麦和水稻中均发现蔗糖含量降低，分蘖芽无法正常生长[5，6]。在水稻营养生长期，氮供应不足时有效分蘖数会大量降低，而氮素供应充足则会促进分蘖的发生，因此氮素对水稻生长及其分蘖的发生起到了关键作用[7，8]。植物根系吸收的氮素主要来源于土壤中的无机氮，以硝态氮（NO3-）和铵态氮（NH4+）为主。植物吸收硝态氮后，少量硝态氮可在根系被同化为氨基酸和蛋白质，或被根部细胞的液泡暂时贮存，不被同化;大量硝态氮则是通过木质部向上运输，进入叶片贮存或被同化[9]。硝态氮的还原主要由硝酸还原酶（Nitrate reductase，NR）和亚硝酸盐还原酶（Nitrite reductase，NiR）催化完成，即硝态氮在胞质中被NR还原为亚硝态氮（Nitrite，NO2-），然后亚硝态氮被NiR还原成氨气，氨气溶于水变为铵根离子[10，11]。不论是直接来源于土壤或空气中的氮，包括根系直接吸收的NH4+，根系直接吸收NO3-还原的NH4+以及生物固氮产生的NH4+，还是来源于植物自身代谢产生的NH4+， 包括叶片衰老时蛋白质降解产生的NH4+、种子萌发时产生的氮、光呼吸产生的NH4+以及木质素合成和氨基酸代谢产生的NH4+，都需要经过GS/GOGAT同化途径：GS催化1分子的NH4+与1分子的谷氨酸（Glutamate，Glu）合成1分子的谷氨酰胺（Glutamine，Gln），GOGAT则催化1分子的Gln和1分子的α-酮戊二酸（2-Oxogluatarate，2-OG）形成2分子的谷氨酸，其中1分子谷氨酸作为GS的底物重新参与NH4+的同化，另一分子谷氨酸则合成各种氨基酸进入植物体内的氮代谢过程，这两个反应偶合在一起，被称为GS/GOGAT循环[12]。GS依赖ATP催化谷氨酸合成谷氨酰胺;GOGAT在铁氧化还原蛋白（Fd）或者NADH的存在下催化Gln和2-OG合成Glu[12-17]。GS/GOGAT循环在无机氮同化为有机氮的过程中起到了至关重要的作用[18]。此外，谷氨酸脱氢酶（Glutamate dehydrogenase，GDH）在维持植物氮平衡中也起着重要作用。当植物体内氮素含量过高时，GDH 能催化NH4+与2-OG结合形成谷氨酸，并将谷氨酸转运到植物体其他组织内贮存，以防止NH4+含量过高对植物产生毒害作用;当植物体氮素含量降低时，GDH分解谷氨酸为氮代谢反应提供氮素，从而保证氮代谢的正常运转[19-21]。可溶性蛋白质是许多植物体内酶的重要组成部分，参与植物多种生理生化代谢过程的调控， 与植物的生长发育、成熟衰老和抗逆性等密切相关[22，23]。在植物体内，游离氨基酸是含氮有机化合物的主要形式，其含量变化影响着植物体的各种代谢反应，反映植物体对氮素的吸收、运输和同化能力[24]。

成穗数是水稻产量的重要构成因素之一，而秧苗的有效分蘖数又是决定穗数的重要因素，过低或过高的分蘖数都会影响单位面积产量[2]。控制水稻的无效分蘖和提高成穗率是提高水稻产量的重要手段。水稻低节位（1～3节位）分蘖产生的时间早，伴随主茎生长的时间长，一生总叶片数多，所产生分蘖又分布于群体的上层，受光条件好，有增加有效穗、叶面积和生物量的最大潜力，是培育高产水稻品种的重要研究内容之一[25]。水稻分蘖与理想株型、环境、植株生长、生理特性、生长调节因子和分蘖相关基因以及产量形成等方面已有较多研究，但针对低节位早发分蘖的研究还比较少。本研究考察了不同水稻品种（系）的分蘖特性及其叶片形态、碳氮代谢指标，并进行了相关分析和聚类分析。其研究结果将为筛选早期低节位分蘖多、分蘖发生速率快且符合理想株型叶片形态的优良水稻品种（系）提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  试验材料及其种植

试验材料为31个籼亚种的水稻品种（系），分别为HR160、HD9802S、珍汕97B、岳4B、早优143、地谷、昌早2号、中嘉早17、天丰B、华占、H925S、R433、五三丝苗、R288、粤泰B、新香6号、窄叶青8号、扬两优6号、广粘63S、R900、特青、绵恢725、明恢63、IR64、C815S、9311/PAY1、W1111、鄂早18、R2257、R600、桂朝2號。

以上材料于2018年6—7月在武汉大学杂交水稻国家重点实验室鄂州试验基地试验田内进行材料的种植以及取样。

播种前，首先用清水选种，然后浸种，使用强氯精杀菌可防止种子带病，最后催芽（三浸三滤），以提高发芽势、发芽率和出苗整齐度。播种时，均采用秧盘（秧盘泥土取自翻耕后的试验田）点播，秧盘每孔播1粒芽长一致的种子，按种子根朝下芽朝上播种。将秧盘按标签依次摆放在试验田，秧盘里面泥土保持湿润。做好各种预防鸟害、鼠害措施。

试验田翻耕前施德沃尔复合肥（N、P2O5、K2O含量均为16%，总养分≥48%，硝态氮含量≥7%）作为底肥，按照450 kg/hm2均匀施撒，然后翻耕整田，要求田面平整，最后用划行器在试验田里划出大小一致的格子，选择生长一致的一叶一心期幼苗移栽至试验田，行距为20.0 cm，株距为16.7 cm。材料生长过程中，田面始终维持浅水层状态，并严格控制病虫害和杂草。试验采用随机区组设计，小区面积为96 m2（12 m×8 m），设置3次重复。

1.2  水稻秧苗分蘖特性及相关农艺性状的观测

分别于播种后第13、17天统计每株材料各个叶位的分蘖情况，并计算出每份材料第一至第三叶位的成蘖率、单株一级分蘖数以及播种后第17天单株总分蘖数、播种后第13～17天的分蘖发生速率。考虑边缘效应，每份材料每个重复均统计中间3行的18株。

2017年7月对生长至四叶期的试验材料测定叶片形态。每份材料每个重复分别选取6株生长一致的植株，测定前3叶叶片长度和宽度（叶片最宽处）。将每份材料的前3叶剥取分别装入牛皮纸袋并在牛皮纸袋上做标记。杀青后于80 ℃烘箱烘至恒重，分析天平分别称量前3叶的干物质量。

比叶重=干物质量/（叶长×最大叶宽×0.75）

1.3  水稻秧苗生理生化指标的测定

三叶一心期取地上部分置于牛皮纸袋中高温暴晒杀青，80 ℃烘干至恒重，用于蔗糖、可溶性糖含量测定。三叶一心期取地上部分，用液氮保存并转移至-80 ℃超低温冰箱贮存，用于硝态氮、可溶性蛋白质、游离氨基酸含量及硝酸还原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合酶（NADH-GOGAT）、谷氨酸脱氢酶（NADH-GDH）活性的測定。

粗酶液提取及保存参考卢永恩[18]的方法;蔗糖、可溶性糖、硝态氮、可溶性蛋白质、游离氨基酸含量及硝酸还原酶活性的测定参考文献[26，27];谷氨酰胺合成酶活性检测参考Rhodes等[28]报道的方法;NADH-GOGAT活性测定参照Hecht等[29]的方法;NADH-GDH活性测定参照Turano等[30]的方法进行。

1.4  数据分析

利用Excel软件和SPSS 20.0软件进行相关性分析，以筛选出与籼稻低节位早发分蘖密切相关的指标。统计性状依次为第一叶位成蘖率、第二叶位成蘖率、第三叶位成蘖率、播种后第13天单株一级分蘖数、播种后第17天单株一级分蘖数、播种后第17天单株总分蘖数、播种后第13～17天的分蘖发生速率、第一叶叶长、第一叶叶宽、第一叶干物质量、第一叶比叶重、第二叶叶长、第二叶叶宽、第二叶干物质量、第二叶比叶重、第三叶叶长、第三叶叶宽、第三叶干物质量、第三叶比叶重、蔗糖含量、可溶性糖含量、硝态氮含量、可溶性蛋白质含量、游离氨基酸含量、硝酸还原酶（NR）活性、谷氨酰胺合成酶（GS）活性、谷氨酸合酶（NADH-GOGAT）活性、谷氨酸脱氢酶（NADH-GDH）活性共28个指标。以这些指标为基础数据，并利用R软件进行聚类分析[31]。

2  结果与分析

2.1  不同水稻品种（系）第一至第三叶位成蘖率

为了研究水稻品种低节位早发分蘖的发生情况，观测了31个水稻品种（系）第一至第三叶位的成蘖率。由图1可知，第一叶位成蘖率极高（96%～100%）的水稻品种（系）有9个，分别是广粘63S、HR160、C815S、岳4B、早优143、窄叶青8号、扬两优6号、绵恢725和R600;第一叶位成蘖率较高（81%～93%）的水稻品种（系）有10个，分别是R288、H925S、新香6号、R433、五三丝苗、明恢63、桂朝2号、鄂早18、HD9802S和IR64;第一叶位成蘖率居中（56%～78%）的水稻品种（系）有6个，分别是华占、天丰B、R2257、9311/PAY1、特青、粤泰B;第一叶位成蘖率较低（39%～49%）的水稻品种（系）有3个，分别是昌早2号、地谷和W1111;其余的3个水稻品种（系）第一叶位成蘖率极低（11%～20%），分别是R900、中嘉早17和珍汕97B。由此可见，在正常栽培条件下，不同水稻品种（系）第一叶位成蘖率存在广泛变异，而第二、第三叶位成蘖率均达到100%。虽然水稻分蘖能力强弱存在品种间差异，但本研究结果表明，在正常培养条件下，不同水稻品种早发分蘖的差异叶位主要体现在第一叶位上。

2.2  水稻品种（系）分蘖特性与前3叶形态性状之间的相关性分析

为了探究不同水稻品种低节位早发分蘖与水稻秧苗前3叶形态性状之间的联系，对31个水稻品种（系）分蘖特性和前3叶形态性状进行了相关性分析，结果（表1）显示，第一叶位成蘖率与第一叶叶长、第二叶叶长、第二叶比叶重都呈极显著正相关，相关系数分别为0.549、0.458和0.484;与第二叶叶宽呈显著负相关，相关系数为-0.452;与第一叶干物质量呈显著正相关，相关系数为0.381。播种后第13天单株一级分蘖数与第一叶叶宽、第一叶干物质量、第二叶干物质量都呈显著负相关，相关系数分别为 -0.451、-0.375和-0.512;与第三叶叶宽、第三叶干物质量都呈极显著负相关，相关系数分别为-0.556和-0.592。播种后第17天单株一级分蘖数与第一叶、第二叶、第三叶的叶宽都呈极显著负相关，相关系数分别为-0.496、-0.504和-0.613;与第三叶干物质量呈显著负相关，相关系数为-0.403。播种后第17天单株总分蘖数与第一叶、第二叶、第三叶叶宽呈极显著负相关，相关系数分别为-0.461、-0.470和-0.573;与第三叶干物质量呈显著负相关，相关系数为-0.422。由于二级分蘖发生得比较少，播种后第17天单株一级分蘖数和总分蘖数与前3叶叶片形态相关性一致。播种后第13～17天分蘖发生速率与第二叶叶长、第三叶叶长、第二叶干物质量都呈极显著正相关，相关系数分别为0.468、0.513和0.409;与第一叶叶长、第二叶比叶重、第三叶干物质量都呈显著正相关，相关系数分别为0.373、0.366和0.402。以上结果表明，水稻秧苗前3叶的叶片形态是影响水稻低节位早发分蘖形成的重要因素之一。

2.3  水稻品种（系）分蘖特性与碳氮代谢指标之间的相关性分析

为了探索不同水稻品种（系）分蘖特性和碳氮代谢之间的联系，对31个水稻品种（系）分蘖特性和碳氮代谢指标进行了相关性分析，结果（表2）表明，第一叶位成蘖率与秧苗硝态氮含量呈显著负相关，相关系数为-0.415;与秧苗可溶性蛋白质含量和NADH-GOGAT活性都呈显著正相关，相关系数分别为0.378和0.410;与NADH-GDH活性呈极显著正相关，相关系数为0.475。播种后第13天单株一级分蘖数与NADH-GDH活性呈显著正相关，相关系数为0.411。播种后第17天单株一级分蘖数与NADH-GOGAT活性呈极显著正相关、与NADH-GDH活性呈显著正相关，相关系数分别为0.424和0.366。播种后第17天单株总分蘖数与NADH-GOGAT活性、NADH-GDH活性都呈显著正相关，相关系数分别为0.395和0.415。播种后第13～17天分蘖发生速率与蔗糖含量呈极显著正相关，相关系数为0.497;与硝态氮含量呈极显著负相关，相关系数为-0.520。播种后第13～17 d分蘖发生速率与植株蔗糖含量呈正相关，说明光合作用贮存的碳水化合物促进了水稻分蘖芽的正常生长和伸长。在早期低节位分蘖发生过程中，硝态氮含量与第一叶位成蘖率、播种后第13～17天分蘖发生速率呈负相关，同时氮同化酶NADH-GOGAT和NADH-GDH活性始终与分蘖数呈正相关，说明植株体内硝态氮被大量消耗还原成NH4+，氮同化酶进一步将NH4+同化为促进分蘖生长的各种有机态氮。由此可见，氮代谢对低节位早发分蘖至关重要。以上研究表明，水稻植株体内蔗糖影响分蘖发生速率，但不影响分蘖数量;硝态氮含量既影响分蘖发生速率，也影响水稻分蘖数量，氮代谢酶NADG-GOGAT和NADG-GDH的活性能促进水稻低节位分蘖的发生。

2.4  基于水稻分蘖特性、前3叶形态性状和碳氮代谢指标的水稻品种（系）聚类分析

为了更清楚地了解各水稻品种（系）早发分蘖的情况，以分蘖特性、前3叶形态性状和碳氮代谢指标等28个不同的性状为基础，采用系统聚类法中的最长距离法对主要性状进行聚类，将31个水稻品种（系）分为A类、B类、C类3大类（图2），可以看出3类群间的距离大于类群内的距离，符合聚类分析的原则。其中，A类包括中嘉早17、珍汕97B、地谷、C815S、岳4B、窄叶青8号、IR64、天丰B、鄂早18、R288、桂朝2号、粤泰B、特青、W1111;B类包括R900、9311/PAY1;C类包括广粘63S、早优143、扬两优6号、R433、R600、R2257、HD9802S、昌早2号、H925S、明恢63、华占、五三丝苗、新香6号、HR160、绵恢725。

基于以上聚类结果，求出各类水稻材料不同性状的平均值，并在各類品种间做方差分析，以便进一步比较3类水稻材料不同性状之间的差异（图3）。其中，A类和C类材料第一叶位成蘖率、播种后第13天单株一级分蘖数、播种后第17天单株一级分蘖数、播种后第17天单株总分蘖数均较高，但A类材料播种后第13～17天分蘖发生速率较低，而C类材料播种后第13～17天分蘖发生速率较高。A类材料前3叶叶长均较短，叶宽均较窄，干物质量均较低。C类材料前3叶叶长均较长，叶宽均较窄，干物质量均较高。B类材料第一叶位成蘖率、播种后第13天单株一级分蘖数、播种后第17天单株一级分蘖数、播种后第17天单株总分蘖数以及播种后第13～17天分蘖发生速率均较低，前3叶叶宽均较宽。以上结果表明，C类材料是分蘖发生较早且分蘖发生速率快、叶片形态更接近于理想株型叶片形态的优质育种材料。

3  讨论

水稻分蘖芽处于二幼一基期之前对外界环境因素不敏感，但其后续生长发育就会受环境因素影响，光、温、水、肥都会影响水稻分蘖的发生，水稻分蘖芽在三幼一基期对环境最为敏感，分蘖芽度过三幼一基期进入四幼一基期后，即使是生长条件稍恶劣，也可出蘖形成正常分蘖[32]。由于秧盘播种和田间施加适宜的底肥，田间维持浅水层状态，且温度高、日照充足、营养生长旺盛，使得多数籼亚种水稻品种（系）第一至第三叶位的分蘖芽顺利度过三幼一基期，各个材料低节位分蘖均发生得多且快。

叶片是植物进行光合作用和呼吸作用的主要场所，是株型构成的重要组成部分，而株型与作物产量又密不可分。同时，叶片作为植株的“源”器官，提供谷粒构成所必需的大部分有机物。许多育种家提出不同生态型的超高产水稻理想株型模式，如杨守仁等[33]的“理想株型”及陈温福[34]的直立穗型、黄耀祥等[35，36]的半矮秆丛生快长超高产株型模式、周开达等[37]的重穗型和袁隆平[38]的超级稻形态模式，都对叶片形态提出了详细的量化指标。在株型育种中，窄叶性状是一个极为重要的叶片性状，特别是在长江中下游稻区，光照条件比较充足，窄叶能更为充分地利用光能，水稻株型也表现得较为紧凑，易达到高产。叶片适度变窄变卷，有利于叶片更好地适应强光并减少其体内水分的蒸发，增加光合作用效率，进而达到高产的目的。水稻叶片形态与光合作用强度密切相关，叶长和叶宽都能决定叶片的受光面积，从而影响其营养物质的积累情况，而分蘖能否生长在很大程度上与营养是否充足有关。本研究发现早期低节位分蘖发生速率与前3叶叶长呈正相关，分蘖数与前3叶叶宽呈负相关，说明前3叶叶长和叶宽是决定低节位分蘖能力的因素之一。在育种上，建议将幼苗前3片叶较长且较窄作为筛选早发分蘖水稻品种的参考形态指标，一定程度上为株型育种提供了理论支撑。

植物的生长发育与其自身稳定的内环境密不可分。水稻植株碳氮代谢与分蘖发生、生长、衰亡密切相关，碳代谢为植株提供能量、碳源及碳骨架。Frank等[39]研究发现，在水稻茎秆中，可溶性碳水化合物含量可以决定分蘖存活率和总茎蘖数。在植物体中，糖类物质远距离运输的主要形式是蔗糖。Michael等[40]在豌豆去顶试验中发现，去除茎尖后，腋芽开始生长，腋芽内生长素含量未发生变化，而糖开始重新分配，蔗糖开始积累，说明侧芽生长的起始不受顶端生长素供应的影响，蔗糖在这个过程中起到了关键作用。有研究[5，6]证实，蔗糖含量降低，分蘖芽无法正常生长。Koumoto等[6]研究发现，与野生型水稻相比，moc2突变体的蔗糖合成途径中关键酶胞质FBP1酶的活性缺失，导致蔗糖供应不足，分蘖芽的生长受到抑制，生长速率减缓，表现为单茎的表型。本研究中发现蔗糖含量与低节位的分蘖发生速率呈极显著正相关，与前人研究基本一致，说明早期低节位分蘖芽的伸长受糖含量调控，水稻植株碳代谢影响分蘖发生快慢，但不影响分蘖多少。Tabuchi等[41]认为氮素是植物生长所必需的大量元素之一，也是决定植物生物量和作物产量的主要限制因素，人们常常通过施用过量的氮肥来保证氮供应充足。Liu等[7]研究发现，在水稻营养生长期，氮供应不足会导致有效分蘖数大量减少，充足的氮素可以促进分蘖。本研究发现，硝态氮含量与低节位分蘖发生速率呈极显著负相关，氮同化酶活性与分蘖数呈显著或极显著正相关，说明氮代谢既影响低节位分蘖发生速率，也影响水稻低节位分蘖数量。在生产上，建议适量使用含氮素的复合肥，确保水稻低节位分蘖早发，成大穗，达到高产的目的。

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