大黄蛰虫胶囊联合恩替卡韦对乙肝肝硬化患者肝纤维化及T细胞亚群的影响

姚仲彩, 蔡亚军, 石勇明, 高东凯

诸暨市人民医院 1感染科， 2药剂科(浙江绍兴 311810)

慢性乙型肝炎(chronic viral hepatitis B，CHB)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染产生的传染性疾病，全球2.4亿CHB患者，约 65 万人死于HBV肝硬化和肝细胞癌等严重疾病[1]。肝纤维化是CHB发展至肝硬化的必经过程，积极开展抗病毒及抗纤维化治疗，早期肝硬化仍可能逆转。目前临床上首选恩替卡韦进行HBV治疗，其主要药理机制与HBV多聚酶的三磷酸脱氧鸟嘌呤核苷竞争，抑制HBV多聚酶启动，有效地阻碍病毒复制[2]。但恩替卡韦长期应用效果不佳，陈娟娟等[3]研究发现，恩替卡韦治疗后HBV得到快速有效控制，但短期肝纤维化改善尚不明显[3]。随着中医药治疗肝硬化研究的深入，其通过抗炎护肝、清除自由基、抗氧化等作用，促进肝病转归[4-5]。其中，大黄蛰虫胶囊具有抗肝纤维化、活血祛瘀、通经消癥等作用[6]，但目前就大黄蛰虫胶囊联合恩替卡韦治疗CHB肝硬化鲜有报道。基于此，我院采取该联合用药，分析治疗前后肝功能及肝纤维化等水平，观察临床疗效，探讨其对肝纤维化及T细胞亚群的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年11月至2018年11月我院住院及门诊收治的CHB肝硬化患者64例，其中，男36 例，女28例，年龄(50.44±4.59)岁。根据随机数字表法将64例CHB肝硬化患者分为对照组32例和观察组32例，比较两组性别、年龄、天门氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)及总胆红素(total bilirubin，TBil)，组间差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。

纳入标准：(1)符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015 年版)》[7]乙肝及乙型肝炎肝硬化的诊断标准；(2)符合《肝硬化中西医结合诊疗共识》[8]中肝硬化瘀血阻络证的中医辨证标准：两胁下刺痛，痛处固定，夜间尤甚；胁下可扪及包块；腹部坚满，质硬不能凹陷；腹壁青筋暴露；唇色紫褐；舌质紫暗，有瘀斑或瘀点等；(3)患者既往从未接受过类似的抗病毒药物及抗肝纤维化治疗。排除标准：(1)妊娠期哺乳期妇女；(2)其他原因性肝病；(3)合并心肾等重大脏器病变或恶性肿瘤患者。本研究由我院医学伦理委员会审批且批准，患者及其家属了解并签署知情同意书。

1.2 方法 对照组接受恩替卡韦分散片(江苏正大天晴药业股份有限公司；国药准字H20100019；生产批号：170604；规格：0.5 mg/片)，清晨空腹服用，剂量为1片/次，1次/d。在对照组基础上，观察组患者加用大黄蛰虫胶囊(江苏颐海药业有限责任公司；国药准字Z20054026；生产批号：170905；规格：0.4 g/粒)口服治疗，4粒/次，2次/d，两组患者均连续治疗24周。

1.3 观察指标 (1)肝功能水平比较：两组研究对象治疗前后分别于抽取空腹外周静脉血5 mL，置于肝素钠采血管中，静置30 min，以转速3 000转/min离心10 min，收集上清液，-40℃低温下保存待测，采用罗氏P-800 全自动生化仪测定AST、ALT及TBil水平。(2)比较两组治疗前后肝纤维化指标：采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测肝纤维化血清标志物透明质酸(hyaluronic acid， HA)、层粘连蛋白(laminin，LN)、Ⅳ型胶原(collage typeⅣ,Ⅳ-Co)及Ⅲ型前胶原(procollagen-Ⅲ，PCⅢ)，试剂盒由上海恒远生物科技有限公司提供，操作严格按照说明书进行。(3)比较两组治疗前后影像学指标：采用瞬时弹性成像测定患者肝硬度数值，每次检查同人同机，检测部位为右侧腋前线至腋中线第7、8、9肋间，同一测定部位获取 10 个有效值，取中位数作为检查结果，检测仪器为Echosens公司生产的瞬时弹性波扫描仪；使用腹部彩色多普勒B超检测肝门静脉内径和脾脏厚度，仪器为Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH公司西门子ACUSON S2000全数字彩色多普勒超声仪。(4)比较两组治疗前后T细胞亚群表达：采用流式细胞法检测CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平，检测仪器为美国贝克曼库尔特公司生产的CytoFLEX LX 流式细胞仪，检测试剂由上海恒信化学公司提供，严格按照试剂盒说明书操作。(5)比较两组治疗前后HBV-DNA载量：同期抽取外周静脉血5 mL，静置30 min，转速12 000 r/min离心5 min，弃上清，采用多聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)测定HBV-DNA，按下列条件扩增：93℃ 5 min预变性，然后按93℃45 s-55℃120 s, 共做40个循环。试剂盒为中山大学达安基因诊断中心产品，检测仪器为美国Perkin Elmer 公司PE 7700自动荧光PCR仪。(6)比较两组治疗前后总有效率。

1.4 疗效评估 临床疗效判断标准:结合《肝纤维化中西医结合诊疗指南》及《肝纤维化中西医结合诊疗共识意见》(2017年版)[9]对乙肝肝硬化代偿期总体疗效判断标准：(1) 显效: 症状和影像学指标基本消失，肝功能显著改善，指标降低>50%，肝纤维指标中有 2 项检测值下降>40%,HBV-DNA 阴转； (2) 有效: 症状、体征改善，肝功能好转，指标降低>50%，肝纤维指标中有2项检测值降低30%～40%,HBV-DNA降低>2个log；(3)无效:症状、体征无变化，肝功能、肝纤维化指标和HBV-DNA无明显变化甚至加重。总有效率(%)=(显效+有效)/总例数×100。

2 结果

2.1 两组肝功能水平比较 治疗前，观察组与对照组AST、ALT、TBil、HBV-DNA载量比较，差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后，两组肝功能指标较治疗前出现下降(P<0.05)，同时，观察组AST、ALT、TBil、HBV-DNA载量明显低于对照组(P<0.05)。见表2。

项目例数AST(U/L)ALT(U/L)治疗前治疗后治疗前治疗后观察组3269.61±12.2733.57±5.70∗88.90±20.0238.38±8.44∗对照组3267.27±15.6839.41±8.20∗81.68±20.5643.75±9.97∗t值0.666-2.5151.423-2.324P值0.5080.0150.1600.023项目例数TBil(μmol/L)HBV-DNA载量(log)治疗前治疗后治疗前治疗后观察组3233.90±7.4218.25±2.98∗6.73±1.513.74±0.67∗对照组3236.07±6.3521.09±3.45∗6.49±1.234.59±0.97∗t值-1.255-3.5150.725-4.058P值0.2140.0010.4710.000

*与同组治疗前比较P<0.05

2.2 两组肝纤维化指标比较 治疗前，两组患者HA、LN、Ⅳ-Co、PCⅢ比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与治疗前比较，两组肝纤维化水平均出现显著下降(P<0.05)，同时观察组均显著低于对照组(P<0.05)。见表3。

项目例数HA(μg/L)LN(μg/L)治疗前治疗后治疗前治疗后观察组32183.60±64.70124.91±35.99∗201.67±56.27145.78±38.04∗对照组32186.62±50.19160.12±39.64∗230.00±67.20181.35±47.65∗t值-0.209-3.721-1.853-3.300P值0.8350.0000.0690.002项目例数Ⅳ-Co(μg/L)PCⅢ(μg/L)治疗前治疗后治疗前治疗后观察组32177.41±63.2597.93±35.95∗204.39±60.63113.89±20.39∗对照组32161.72±61.34124.88±35.14∗197.27±58.43143.50±29.61∗t值1.005-3.0330.479-4.658P值0.3190.0040.6340.000

*与同组治疗前比较P<0.05

2.3 两组影像学指标比较 治疗后，两组患者肝门静脉内径、脾脏厚度、肝脏硬度数值显著降低，同组治疗前后比较差异有统计学意义(P<0.05)；治疗后观察组肝门静脉内径、脾脏厚度、肝脏硬度数值低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

项目例数肝门静脉内径(mm)脾脏厚度(mm)肝脏硬度数值(kPa)治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后观察组3214.99±0.3813.02±0.39∗44.94±0.8140.01±0.57∗20.99±0.1713.93±0.32∗对照组3214.96±0.3313.51±0.41∗45.10±0.9441.04±0.51∗20.43±0.1917.94±0.25∗t值0.339-4.839-0.758-7.635-0.229-56.263P值0.7360.0000.4510.0000.8190.000

*与同组治疗前比较P<0.05

2.4 两组T细胞亚群表达比较 治疗前，观察组与对照组T细胞亚群差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后，两组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+数值显著上升，CD8+水平下降，差异有统计学意义(P<0.05)，观察组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平高于对照组，CD8+低于对照组，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

项目例数CD3+(%)CD4+(%)治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后观察组3253.10±6.8669.94±5.87∗31.53±2.7238.58±2.76∗对照组3250.98±5.4559.82±6.83∗30.66±3.3832.81±2.82∗t值1.3636.3601.1348.262P值0.1780.0000.2610.000项目例数CD8+(%)CD4+ /CD8+治疗前治疗后治疗前治疗后观察组3236.14±4.1329.58±3.30∗1.03±0.251.47±0.15∗对照组3235.50±3.5531.68±3.00∗1.04±0.261.32±0.16∗t值0.655-2.657-0.1094.232P值0.5150.0100.9140.000

*与同组治疗前比较P<0.05

2.5 两组临床总有效率比较 观察组显效15例，有效12例，总有效率为84.4%，高于对照组显效10例，有效9例，总有效率62.5%，差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 两组临床总有效率比较 例(%)

3 讨论

目前，HBV感染呈世界性流行，我国为高流行区，HBV感染者约9 300万人，其中CHB患者约2 000万例，且发病率逐年升高[10]。慢性感染HBV时，特异性T淋巴细胞易凋亡，分泌细胞因子功能和增殖能力显著降低，T淋巴细胞功能耗竭，HBV持续复制，炎症因子介导的炎症反应反复发生，再生及结缔组织增生，进而形成纤维隔，逐步进展为肝纤维化和肝硬化[11]。CHB患者肝硬化年发生率为2%～10%，失代偿性肝硬化5年生存率仅为14%～35%[7]，因此，应尽早抑制HBV复制，改善肝细胞病理损伤及肝纤维化，提高患者生活质量，延长生存时间。《慢性乙型肝炎防治指南》(2015年版)》中推荐起始治疗优先使用恩替卡韦，恩替卡韦是一种脱氧鸟嘌呤核苷酸类似物，与 HBV 逆转录的自然底物dGTP竞争结合相同位点，选择性地抑制HBV的逆转录酶。国内外临床研究显示，该药物有效缓解肝组织病变，改善肝纤维化，逆转肝硬化[12-13]，随访研究表明，24 周HBeAg阳性转阴率为56.25%，48周转阴率为79.17%；HBV-DNA 载量由6.2下降至3.1 log copies/mL[14]。但部分患者服药后出现疲劳、头晕、头痛、呕吐等症状，长期服药有引发乳酸酸中毒的风险[15]，故常需要联合其他药物以提高整体疗效。

近年来，在中医辨证治疗的基础上，中药及中成药针对病因病机，四诊合参，已形成肝纤维化中西医结合诊疗共识意见，中医药结合恩替卡韦治疗CHB疗效显著，能改善肝功能并阻止纤维化进程，一定程度上逆转肝硬化[16]。王志炜等[17]研究疏肝健脾活血方联合恩替卡韦指标肝硬化，治疗后总有效率为 89.47%高于对照组71.05%，观察组 HBV-DNA由5.92下降为1.93 log10copies/mL[17]。中医认为，肝硬化属“胁痛”、“黄疸”、“积聚”、“鼓胀”、“肝积”等范畴，内因是外邪入侵，外因是湿热疫毒，病机以“瘀血阻络，经脉闭阻”多见，应治以“活血化瘀，通经消癥”为法。本研究所用药为大黄蛰虫胶囊，其是有《金匮要略》名方“五劳虚极，羸瘦腹满，不能饮食……内有干血，肌肤甲错，两目黯黑，缓中补虚，大黄虫丸主之”化裁而来，含草木药(熟大黄、黄芩、地黄、干漆、苦杏仁、桃仁、白芍、甘草)及虫类药(蛰虫、虻虫、水蛭、蛴螬)，具有活血散瘀、通经散结、升降气机、柔肝止痛、通经消癥之效。本研究结果显示，观察组临床疗效(84.4%)明显高于对照组(62.5%)，而经治疗后，肝功能指标及肝纤维化水平则明显低于对照组，证实联合恩替卡韦给药能促进肝功能复常，改善肝纤维化，对CHB患者治疗有积极协同作用。这与石俊、杨波等[18-19]研究结论一致，其研究显示，联合服用恩替卡韦分散片和大黄蟅虫丸患者有效率为92.41%高于单服恩替卡韦分散片患者69.23%，且ALT、AST及TBil等指标下降幅度高于单独服药组。这可能与大黄蛰虫胶囊抑制肝星状细胞中 p38MAPK信号通路，阻碍磷酸化 p38MAPK 表达，减少肝星状细胞形成，起到抗肝纤维化作用有关[20]。大黄蛰虫胶囊成分大黄具有调节免疫力、消除自由基、抗肝纤维化等作用，通过抑制 CCL4诱导的肝细胞 Smad3 mRNA、PDGF-B、转化生长因子-β1(TGF-β1) 表达，实现逆转肝纤维化的作用[21]；水蛭具有抗炎、抗肝纤维化及抑制细胞凋亡等作用，抑制肝脏结缔组织生长因子mRNA 表达，从而加强整体抗肝纤维化效果；桃仁具有保护肝肾、调节免疫、营养神经等作用，通过抑制Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型胶原的合成，促进纤维连接蛋白的降解，以实现肝纤维逆转。

HBV不直接损伤肝细胞，其通过诱发免疫应答失调，导致炎症反复发生及肝细胞损伤。细胞免疫在免疫应答中起着决定性作用，临床上通过T细胞亚群检测指标反映免疫状况，CD3+参与T淋巴细胞的信号转导；CD4+表达于辅助T细胞，识别抗原的信号转导，当存在感染和炎症时，介导前炎症反应；CD8+属于细胞毒性T细胞，对被病毒感染的特异性抗原细胞具有直接杀伤作用；CD4/CD8比值可有效反应细胞免疫功能水平。且研究显示，CHB肝硬化患者T 细胞亚群失调，CD3+、CD4+、CD4/CD8比值降低，CD8+下降，增加 B淋巴细胞的分泌, 使体液免疫亢进,在补体激活的情况下，出现免疫复合物黏附和沉积现象, 导致肝细胞病理性改变，从而使肝功能受损[22]。张小玉等[23]研究证实恩替卡韦能提高外周血淋巴细胞CD3+、CD4+和CD8+比例，改善机体部分免疫功能，但大黄蛰虫胶囊联合恩替卡韦治疗对CHB患者T细胞亚群影响尚无相关报道。本研究结果显示，大黄蛰虫胶囊联合恩替卡韦治疗后，CD3+由53.10%上升为69.94%，CD4+水平由31.53%上升为38.58%，CD4/CD8比值由1.03上升为1.47，均明显高于恩替卡韦单独用药，且HBV-DNA载量由6.73降低为3.74log copies /mL，低于对照组，表明大黄蛰虫胶囊可增强恩替卡韦改善机体免疫效能，有效调节T细胞亚群平衡状态，改善机体免疫应答功能。本研究样本量较少，临床应用和推广仍有一定局限性，下一步研究将开展大样本多中心研究，探索大黄蛰虫胶囊联合恩替卡韦不同在HBV-DNA载量水平的疗效。

综上所述，大黄蛰虫胶囊联合恩替卡韦用药治疗CHB肝硬化患者疗效显著，可降低HBV-DNA载量，促进肝功能复常，改善肝纤维化，调节T淋巴细胞亚群，提高机体免疫状态。