膈肌呼出气一氧化氮浓度、一氧化氮合酶表达水平及炎性因子水平与食管病变并慢性阻塞性肺疾病患者膈肌活动度的相关性研究

王慧，张鑫，薛乾隆，杨淼

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是因长期慢性气道炎症引起的气道重塑、气流受限性疾病，严重影响患者的肺功能及生活质量。膈肌是人体重要的呼吸肌，由膈肌介导的呼吸功能占所有呼吸肌的60%～70%［1-2］。COPD患者需用力呼吸才能保证肺泡通气量，但长期用力呼吸可增加膈肌负担，导致膈肌疲劳，且膈肌机械位移范围可随肺过度充气、肺容量增加而缩小［3-4］，进而导致膈肌活动度下降［5-6］。目前COPD患者膈肌活动度改变的潜在分子机制尚不完全明确。一氧化氮（NO）是由一氧化氮合酶（NOS）催化精氨酸生成的重要气体信号分子。COPD患者气道慢性炎症可使NOS表达上调［7］、NO生成增多，而气道NO既可刺激炎性细胞活化和浸润、放大炎性反应，又可启动肌肉的兴奋收缩耦联、引起气道平滑肌及膈肌过度收缩［8-9］。本研究旨在探讨膈肌呼出气一氧化氮（FeNO）浓度、NOS表达水平及炎性因子水平与食管病变并COPD患者膈肌活动度的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年6月—2018年12月河北北方学院附属第一医院收治的食管病变行开胸手术患者48例。纳入标准：（1）术前完善肺功能及FeNO浓度检查；（2）术中留取膈肌标本；（3）近期未接受糖皮质激素及β2-受体激动剂治疗。排除标准：（1）胸廓畸形、脊柱畸形者；（2）合并肺间质疾病、支气管哮喘者；（3）合并自身免疫性疾病及肝肾功能异常者。根据术前是否合并COPD将所有患者分为对照组（未合并COPD，n=26）和COPD组（合并COPD，n=22）。对照组患者中男16例，女10例；年龄51～69岁，平均年龄（59.9±8.6）岁；体质指数（22.08±3.77）kg/m2；吸烟史10例；合并症：高血压13例，糖尿病9例；实验室检查指标：血肌酐（70.14±10.77）mmol/L，丙氨酸氨基转移酶（ALT）（22.93±5.95）U/L，天冬氨酸氨基转移酶（AST）（21.25±7.14）U/L，pH值（7.41±0.89）；左心室射血分数（LVEF）（64.58±9.34）%。COPD组患者中男14例，女8例；年龄52～71岁，平均年龄（60.3±8.2）岁；体质指数（21.61±3.42）kg/m2；吸烟史11例；合并症：高血压12例，糖尿病8例；实验室检查指标：血肌酐（72.38±9.93）mmol/L，ALT（24.12±5.23）U/L，AST（21.93±4.58）U/L，pH 值（7.37±0.95）；LVEF（65.24±9.97）%。两组患者性别（χ2=0.022）、年龄（t=0.164）、体质指数（t=0.449）、吸烟率（χ2=0.645）、高血压发生率（χ2=0.099）、糖尿病发生率（χ2=0.016）、血肌酐（t=0.744）、ALT（t=0.729）、AST（t=0.384）、pH值（t=0.150）、LVEF（t=0.237）比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经河北北方学院附属第一医院医学伦理委员会审核批准（批准号：20150012），患者及家属对本研究知情。

1.2 主要仪器及试剂 主要仪器：肺功能仪购自德国耶格公司，FeNO测定系统购自瑞典尼尔斯公司；主要试剂：超纯RNA提取试剂盒、SuperRT cDNA第一链合成试剂盒、UltraSYBR Mixture试剂盒均购自北京康为世纪生物科技有限公司，蛋白裂解液购自Invitrogen公司，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、神经型一氧化氮合酶（nNOS）的第一抗体均购自Abcam公司，酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司。

1.3 观察指标

1.3.1 膈肌活动度 比较两组患者膈肌活动度。检查膈肌时，患者取仰卧位，将探头置于患者右肋下缘、腋前线与锁骨中线中点处，方向指向右肩部，获取清晰的膈肌图像后记录患者在呼吸运动过程中膈肌超声信号的波峰与波谷，根据波峰与波谷计算膈肌活动度。

1.3.2 FeNO浓度 术前采用FeNO测定系统检测两组患者膈肌FeNO浓度，采用过滤器吸入外源性NO至最大肺活量后指导患者以50 ml/s的气流速度呼气，呼气压力为10～20 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa），FeNO测定系统可自动计算结果。本研究所使用的FeNO测定系统具备全面质量控制功能：当患者在测定过程中出现呼吸过弱或过强、漏气、咳嗽和逆向呼或吸等情况时，系统主机可自动强行终止测定。

1.3.3 膈肌NOS mRNA相对表达量 比较两组患者膈肌NOS（包括iNOS、eNOS、nNOS）mRNA相对表达量。术中，取患者膈肌组织适量，采用超纯RNA提取试剂盒分离、提取组织总RNA，以RNA为模板，采用SuperRT cDNA第一链合成试剂盒将RNA合成cDNA，取cDNA；按照UltraSYBR Mixture试剂盒配置聚合酶链式反应（PCR）反应体系，按照95 ℃ 10 s、特异性退火温度15 s、72 ℃ 25 s的程序反应进行40个循环，仪器上可显示PCR循环曲线及循环阈值，根据循环阈值计算iNOS、eNOS、nNOS的mRNA相对表达量。基因引物序列及特异性退火温度见表1。

表1 iNOS、eNOS、nNOS引物序列及特异性退火温度Table 1 Primer sequence and specific annealing temperature of iNOS，eNOS and nNOS

1.3.4 膈肌NOS蛋白相对表达量 比较两组患者膈肌NOS蛋白相对表达量。取膈肌组织适量，采用蛋白裂解液提取组织总蛋白，蛋白样本经加热、变性后加入聚丙烯酰胺分离凝胶，采用电泳技术将蛋白样本分离、电转移至硝酸纤维素（NC）膜，将NC膜放入5%脱脂牛奶中封闭2 h，洗膜后在4 ℃环境中孵育iNOS、eNOS、nNOS的第一抗体过夜；第2天，洗膜后室温孵育第二抗体2 h，再次洗膜并采用ECL显影系统显示蛋白条带，以目的基因（iNOS、eNOS、nNOS）蛋白条带的灰度值与内参基因β-actin蛋白的灰度值比值为目的蛋白相对表达量。

1.3.5 膈肌炎性因子 比较两组患者膈肌炎性因子〔包括肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）〕水平。取膈肌组织适量，加入磷酸盐缓冲液后进行超声匀浆，将匀浆液在4 ℃离心机中以12 000 r/min离心20 min（离心半径5.5 cm），取上清液，采用ELISA检测患者上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学方法 应用SPSS 23.0统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以（x± s）表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料分析采用χ2检验；膈肌FeNO浓度、NOS表达水平及炎性因子水平与食管病变并COPD患者膈肌活动度的相关性采用Pearson相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膈肌活动度 COPD组患者膈肌活动度为（2.74±0.52）cm，小于对照组的（3.89±0.67）cm，差异有统计学意义（t=6.549，P＜0.05）。

2.2 膈肌FeNO浓度 COPD组患者膈肌FeNO浓度为（37.42±6.23）ppb，高于对照组的（14.52±2.77）ppb，差异有统计学意义（t=16.896，P＜0.05）。

2.3 膈肌NOS mRNA及蛋白相对表达量 COPD组患者膈肌iNOS、eNOS mRNA及蛋白相对表达量高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组患者膈肌nNOS mRNA及蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表2～3、图1）。

2.4 膈肌炎性因子水平 COPD组患者膈肌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表4）。

2.5 相关性分析 Pearson相关分析结果显示，膈肌FeNO浓度、iNOS mRNA相对表达量、eNOS mRNA相对表达量、iNOS蛋白相对表达量、eNOS蛋白相对表达量及TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平均与食管病变并COPD患者膈肌活动度呈负相关（P＜0.05，见表5）。

图1 两组患者膈肌NOS蛋白电泳结果Figure 1 Electrophoretic results of NOS protein in diaphragm in the two groups

表2 两组患者膈肌NOS mRNA相对表达量比较（x±s）Table 2 Comparison of relative expression quantity of NOS mRNA in diaphragm between the two groups

表3 两组患者膈肌NOS蛋白相对表达量比较（x±s）Table 3 Comparison of relative expression quantity of NOS protein in diaphragm between the two groups

表4 两组患者膈肌炎性因子水平比较（x±s）Table 4 Comparison of levels of inflammatory cytokines in diaphragm in between the two groups

表5 膈肌FeNO浓度、NOS表达水平及炎性因子水平与食管病变并COPD患者膈肌活动度的Pearson相关分析结果Table 5 Pearson correlation analysis of FeNO concentration，expression of NOS and levels of inflammatory cytokines in diaphragm with diaphragm mobility in esophageal lesion patients complicated with COPD

3 讨论

COPD是以不可逆气流受限为主要特征的肺部疾病，气流受限导致呼吸肌做功增加，患者需通过用力呼吸而保证肺泡足够的通气量，但长期用力呼吸会引起呼吸肌疲劳甚至损伤［10］。膈肌是人体重要的呼吸肌，也是COPD较易累及的呼吸肌，有研究报道，COPD患者膈肌肌纤维缩短约40%，而肋间肌肌纤维缩短约7%［11］，膈肌疲劳或受损可使肌动蛋白肌丝、肌球蛋白肌丝过度重叠，进而导致患者膈肌活动度下降；此外，COPD患者肺过度充气、残气过多均会直接造成膈肌机械位移，进而加剧膈肌活动度下降［12-13］。本研究结果显示，COPD组患者膈肌活动度小于对照组，提示COPD患者膈肌活动度下降，与刘岷等［6］研究结果一致。

相关研究表明，膈肌收缩功能损伤除与钙离子释放介导的兴奋收缩耦联异常有关外，还与肌细胞损伤有关［14］。气道慢性炎症是COPD患者的基本病理特征，而FeNO是临床评价气道炎症的常用无创指标［15］。NO是人体重要的气体信号分子，可招募炎性因子、放大炎性反应，造成气道平滑肌、膈肌损伤；另外，NO还可通过影响自由基生成、电子链传递等过程而破坏兴奋收缩［16-17］。本研究结果显示，COPD组患者膈肌FeNO浓度高于对照组，且膈肌FeNO浓度与食管病变并COPD患者膈肌活动度与呈负相关，与既往研究结果一致［18-19］，提示COPD患者气道内大量生成的FeNO可通过直接损伤膈肌及兴奋-收缩耦联等使食管病变并COPD患者膈肌活动度下降。

NOS包括iNOS、eNOS、nNOS，可通过催化精氨酸代谢生成NO。张运涛等［7］研究表明，COPD患者膈肌NOS mRNA表达水平升高，但并分析不同类型NOS表达水平。本研究结果显示，COPD组患者膈肌iNOS、eNOS mRNA及蛋白相对表达量高于对照组，但两组患者nNOS mRNA及蛋白相对表达量间无统计学差异，提示iNOS、eNOS可能参与了食管病变并COPD患者膈肌损伤过程。呼吸肌长期过度做功、慢性炎症均可诱导iNOS表达；eNOS与膈肌中内皮细胞功能障碍、毛细血管重构关系密切。本研究结果还显示，膈肌iNOS mRNA相对表达量、eNOS mRNA相对表达量、iNOS蛋白相对表达量、eNOS蛋白相对表达量与食管病变并COPD患者膈肌活动度均呈负相关，提示膈肌iNOS、eNOS表达水平升高可能是导致食管病变并COPD患者膈肌活动度下降的机制之一。

气体信号分子NO具有促炎活性，可通过激活炎性反应而加重膈肌损伤、导致膈肌活动度下降［16-17］。TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8是由NO调控的常见促炎因子［20-22］。本研究结果显示，COPD组患者膈肌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平高于对照组，提示COPD患者膈肌存在炎性反应；进一步行Pearson相关分析显示，膈肌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平均与食管病变并COPD患者膈肌活动度呈负相关，提示膈肌炎性因子水平升高与食管病变并COPD患者膈肌活动度下降有关。

综上所述，膈肌FeNO浓度、iNOS及eNOS表达水平、炎性因子水平升高与食管病变并COPD患者膈肌活动度下降有关；但本研究仅进行了相关性分析，并不能证实膈肌FeNO浓度、iNOS及eNOS表达水平、炎性因子水平升高与食管病变并COPD患者膈肌活动度下降之间的因果关系，今后可结合动物实验进一步验证。

作者贡献：王慧进行文章的构思与设计，研究的实施与可行性分析；张鑫、薛乾隆进行数据收集、整理、分析；杨淼进行结果分析与解释，论文的修订；王慧负责撰写论文，负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。