ATR抑制剂VE-822对人乳腺癌细胞MCF-7的作用

凌 欢 周云峰

乳腺癌是目前女性最常见的恶性肿瘤之一。我国女性乳腺癌发病率逐年升高，根据最新的国家癌症数据统计，每年新发患者近28万，是中国女性发病率最高的恶性肿瘤［1，2］。DNA损伤应答特定基因的遗传性或获得性突变使乳腺癌细胞对特定的DNA损伤应答抑制剂敏感，例如乳腺癌易感基因1/2（Breast cancer susceptibility genes 1/2，BRCA1/2）突变的细胞对poly（ADP-ribose）polymerase（PARP）抑制剂敏感［3］。共济失调毛细血管扩张突变基因Rad3相关激酶（Ataxia telangiectasia mutated，and Rad3 related kinase，ATR）是损伤应答的重要元件，当细胞内出现DNA复制压力或DNA损伤时，ATR与其配体ATRIP结合被招募到RPA-单链 DNA（single-stranded DNA，ssDNA）上形成ATR-ATRIP复合物，并发生自磷酸化；随后 RHINO、Rad17、9-1-1复合物以及 TopBP1，被募集到dsDNA-ssDNA接合处结合ATR自磷酸化位点而激活ATR-ATRIP。随后激活chk1、FANCI、WRN等信号转导通路阻滞细胞周期进程、稳定复制叉并促进DNA的损伤修复［4］。肿瘤细胞较正常细胞更依赖ATR分子调控基因组的损伤修复而促进细胞存活，它对ATR抑制剂的抑制作用更敏感［5］。因此，ATR抑制剂可能为乳腺癌中继PARP抑制剂的另一抑制修复的理想药物。

VE-822是ATR抑制剂VE-821的高选择性和有效的衍生物，体内外研究表明，它可通过抑制Chk1 Ser345的磷酸化而引起细胞周期阻滞和DNA损伤增加［6］。还有研究表明，VE-822通过干扰复制叉的起始和阻碍其延伸而增强三阴性乳腺癌对拓扑异构酶I的敏感性，且增强三阴性乳腺癌的放疗敏感性［7，8］。此外，它还可增强急性髓系白血病对靶向核糖核酸酶的核苷类似物的敏感性，在体内外可提高食管鳞癌和肠癌的化疗敏感性，以及增强胰腺癌放疗敏感性［7～10］。但目前尚无报道包括 VE-822在内的ATR抑制剂是否能够有效杀伤雌激素受体阳性（Estrogen receptor positiv，ER+）的乳腺癌，此类乳腺癌患者约占3/4，且有研究报道ER+的乳腺癌中，ERα信号通路严重干扰了DNA正常的损伤应答［11］。为此，本实验采用不同浓度的VE-822处理的人乳腺癌细胞MCF-7，观察其对细胞增殖、周期和凋亡的影响，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 人类乳腺癌细胞株MCF-7购于中国典型培养物保藏中心，RPMI1640培养基、DMEM培养基和胎牛血清（FBS）购于美国Hyclone公司；VE-822（S8161）购于上海蓝木化工有限公司；CCK8试剂盒、细胞周期（碘化丙啶，Propidium PI法）及细胞凋亡（FITC-Annexin V/PI法）流式检测试剂盒均购于苏州 us everbright公司；p-ATR、p-chk1、γ-H2AX抗体购于美国CST公司，BRCA1抗体购于Proteintech公司，rad51抗体购于美国Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及药物处理 培养人乳腺癌细胞株MCF-7于10 cm细胞培养皿中，用含10%胎牛血清的DMEM培养液，培养条件为37℃，5%CO2孵箱湿润培养。选处于对数培养期的细胞进行后续实验。

1.2.2细胞增殖检测 处于对数培养期的细胞用胰酶消化后，接种于96孔板，每孔2000～5000个细胞培养于100μl DMEM培养基中，贴壁12 h后给予0.5 μM、1μM、2μM、4μM、8μM的VE-822，其中DMSO处理组为对照组，每个浓度设3个复孔。24 h、48 h、72 h后每孔加入10μl CCK8试剂，培养箱培养2 h后用酶标仪检测450 nm处的吸光度（A）值。细胞增殖率=（实验组A值-培养基A值）/（对照组A值-培养基A值）×100%。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡 取对数生长期的MCF-7细胞铺板，贴壁12 h后给予0.5μM VE-822，DMSO处理组为对照组，收集加药后培养24 h的细胞，按细胞周期检测试剂盒说明进一步操作，流式细胞仪检测细胞周期的变化。给与0.5μM、2μM VE822，DMSO处理组为对照组，收集加药后培养72 h的细胞，按细胞凋亡试剂盒实验步骤操作后用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。

1.2.4Western blotting检测蛋白表达 收集不同浓度VE-822处理72h的MCF-7细胞，磷酸盐缓冲（PBS）溶液洗3次，加入RIPA细胞裂解液后超声破碎，离心后取上清，按4∶1比例加入5×蛋白缓冲液SDS，细胞蛋白样品于100℃水浴5 min。采用BCA法将各组细胞样品的蛋白浓度调整一致后，各取10μl蛋白样品进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺SDSPAGE凝胶凝胶电泳，电泳结束后，将凝胶中的蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，含5%的脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭2 h，分别加待检测蛋白的一抗，4℃孵育过夜，TBST溶液洗5次，10 min/次，相应二抗（1∶2000）室温孵育2 h，TBST溶液洗5次，10 min/次，ECL化学发光液显影。

1.3统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件分析实验数据，所有实验均重复3次，计量数据均符合正态分布，以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，多重比较采用LSD-t检验；计数资料使用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VE-822对MCF-7细胞增殖的影响 VE-822实验组较对照组的MCF-7细胞增殖率明显受到抑制（P＜0.05），且随着VE-822浓度及作用时间的增加，细胞增殖抑制的效率升高（P＜0.05）。VE-822作用于MCF-7细胞的24 h的IC50值为5.982 μM，48 h的 IC50值为1.451μM，72 h的 IC50值为0.559μM（图1）。

图1 不同浓度VE-822对MCF-7细胞增殖率的影响

2.2VE-822诱导MCF-7细胞凋亡 流式细胞凋亡分析实验组中经VE-822干预72 h的MCF-7细胞与对照组相比，凋亡明显增多（P＜0.05），特别是0.5 μM、2μM VE-822处理组的MCF-7细胞早期凋亡率较对照组显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）（封四图2）。

2.3VE-822对MCF-7细胞周期的影响 流式检测分析0.5μM VE-822干预24 h的MCF-7细胞，较DMSO对照组，VE-822干预的细胞明显被阻滞在G1期，G1期的细胞比例增加，S和G2/M期的细胞比例减少，差异有统计学意义（P＜0.01）（封四图3）。

2.4VE-822对MCF-7细胞的作用机制 Western blot检测实验组和对照组的 p-ATR、p-chk1、BRCA1、rad51、γ-H2AX的蛋白表达情况，实验组中p-ATR、p-chk1、BRCA1、rad51蛋白含量较对照组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。实验组中 γ-H2AX蛋白含量与对照组相比升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。（图4）

3 讨论

目前，乳腺癌的发病率位居中国女性恶性肿瘤的首位，严重危害女性的健康［12］。其中，激素受体（hormone receptor，HR）阳性的乳腺癌约占75%，虽然内分泌治疗对此类乳腺癌患者提供了重要帮助，但仍有部分患者出现复发或转移［13］。因此，进一步探索此类乳腺癌的生物学行为，寻找调控机制及主要靶点，并对其干预，可为提高生存率提供帮助。损伤修复基因的缺陷不仅与乳腺癌的发生密切相关，异常的修复更是引起传统治疗抵抗的主要原因之一。ER+的乳腺癌中，受ER信号通路的影响，存在异常的DNA损伤修复［11］。

ATR是损伤修复的重要感应元件，当基因组受到损伤时，ATR被激活，募集下游修复因子至损伤部位，从而引起细胞周期阻滞、稳定复制叉、促进DNA的损伤修复［14］。体内外研究表明，高选择性ATR抑制剂VE-822可有效增加包括三阴性乳腺癌在内的多种肿瘤 DNA损伤的持久性［7～10］。

本研究发现，VE-822可降低MCF-7细胞的增值率，且呈现剂量依赖效应。流式凋亡分析及凋亡相关蛋白检测证实此药物可诱导MCF-7细胞凋亡增加。流式细胞周期检测分析提示，VE-822引起MCF-7细胞G1/S期阻滞，与Fokas等的研究结果即VE-822（80 nM）单独增加MiaPaCa-2和PSN-1细胞停留在G1期的比率一致。本研究进一步发现，VE-822处理的 MCF-7细胞的 p-ATR、p-chk1、BRCA1、rad51的表达均下降，γ-H2AX的表达增加。BRCA1不仅是ATR-chk1下游通路的关键效应分子，并且调节碱基切除修复因子如8-oxoG DNA glycosylase 1（OGG1），endonuclease III-like homolog 1（NTH1）和 APE1转录［15］，而γ-H2AX作为DNA双链断裂的标志，与非同源重组修复密切相关。H2AX除了在双链断裂的识别和修复中发挥作用外，还参与DNA复制的监控。组蛋白H2AX还能以ATR依赖的方式磷酸化，以应对复制应激［16］。因此推测VE-822可能通过抑制ATRChk1损伤应答通路，继而通过抑制BRCA1，不仅抑制同源重组修复（homologous recombination，HR），而且可能通过γ-H2AX抑制了非同源重组修复通路（nonhomologous end joining，NHEJ）。因此，VE-822可有效抑制MCF-7细胞修复，使损伤持久，继而诱导凋亡。

综上所述，ATR抑制剂VE-822可有效抑制MCF-7细胞增殖、诱导其G1/S细胞周期阻滞和细胞凋亡。其机制可能通过抑制MCF-7细胞的HR和NHEJ相关通路，使损伤不能被修复相关，具体机制有待进一步研究探讨。VE-822有望成为治疗HR+、HER2-乳腺癌的有效药物，其临床应用效果和价值需要进一步验证。