固定假丝酵母脂肪酶candida rugosa lipase
2019-12-13周蕊邢炎华王燕
周蕊 邢炎华 王燕
摘 要：以壳聚糖-戊二醛（Chitosan-GA）为载体固定假丝酵母脂肪酶candida rugosa lipase（CRL）最高酶活可达240 μ·g-1。Chitosan-GA固定化酶循环使用4次后保留了20%左右的初始酶活力。固定化酶在水相中保存185 d后保留了40%以上初始酶活力。固定化酶在有机溶剂（正庚醇）中浸泡120 h后固定化酶酶活保留32.2%，而游离酶只保留原始酶活的8.5%。Chitosan-GA载体固定化脂肪酶在水相和有机相中的保存稳定性都好于游离酶。
关 键 词：壳聚糖;假丝酵母;初始酶活力;固定化
中图分类号：O629.8 文献标识码： A 文章编号：1671-0460（2019）08-1686-04
Abstract： Chitosan support was synthesized by coupling glutaraldehyde （Chitosan-GA） onto the surface. And then candida rugosa lipase（CRL） was immobilized on this support. The highest activity of immobilized lipase was 240 μ·g-1. The immobilized lipase remained 20% of initial activity even after 4 times of reuse. The drop in the activity of the immobilized lipase after 185 days storage at 4 ℃ did not exceed 60%. Immobilized enzyme is much more stable than free enzyme in aqueous phase and organic phase.Key words： Chitosan; Candida mycoderma; Initial enzyme activity; Immobilization
固定化酶是用固體材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术[1，2]。与游离酶相比，固定化酶具有更多优点[3]。
酶的“柔性固定化”就是在固定化载体上，接上一些有足够长度的且是亲水的分子链，即所谓的“柔性链”，接有柔性链的柔性载体的引入，在制备固定化酶的过程中，当酶与柔性载体相碰撞结合时，就会因柔性链的缓冲作用，使酶保持构象不变以减少酶的活力损失;另外，在柔性固定化酶与底物作用时，被固定到柔性载体上的酶可以更好地保留酶游离态的均相催化活性，还能使酶蛋白构象因受微环境的改变而发生折叠、失活处于亚稳态时，当施加反折叠措施，酶恢复正常构态时，因柔性而位垒更低，更易于恢复，即可增加酶的自恢复能力，从而解决酶蛋白的不稳定性问题[2-6]。
脂肪酶在有机溶剂中具有高的催化活性和立体选择性，因而已广泛应用于制备具有光学活性的醇、脂肪酸及其酯等纯手性医药和农药的中间体[7]。
本文通过研究实现制备Chitosan-GA载体，固定化商品脂肪酶并优化固定条件;Chitosan-GA载体固定化实验室自产耐有机溶剂脂肪酶并优化固定条件。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
细胞破碎仪，Biosafer 250-88，赛飞（中国）有限公司;恒温振荡器，THZ-82，北京国华仪器;真空干燥器，2K-82A，上海试验仪器总厂;磁力加热搅拌器，79-1，常州国华电器有限公司。
壳聚糖，济南海得贝，冰醋酸、六偏磷酸钠、聚乙烯醇、正庚醇、环己烷、无水乙醇、丙酮、戊二醛均为国产分析纯。Candida rugosa脂肪酶：酶的稳定温度2～8 ℃，最佳反应温度为37 ℃，适于水解橄榄油等短链底物。
1.2 固定化材料
1.2.1 Chitosan-GA载体（Chi-GA）的制备
根据文献[8]制备Chitosan（Chi）小球：将壳聚糖 5 g溶解于200 mL 8%的醋酸得到2.5%的壳聚糖的醋酸溶液，并加入20 mL氢氧化钠溶液（0.5 g·mL-1），将所得壳聚糖的醋酸溶液调至pH=6。注入1.5%的六偏磷酸钠溶液中，使壳聚糖液固化成小球，置换新鲜的六偏磷酸钠溶液浸泡一夜。取少量载体，经水洗，醇洗后水泵干燥，再真空干燥过夜。
Chi-GA载体制备：取上述Chitosan小球3 g，加入到1 mL戊二醛（GA，25%）水溶液及15 mL乙醇（50%）水溶液中，70 ℃下反应24 h后，用热、冷水洗5遍，洗去过量的GA，置于磷酸缓冲液（pH=7，0.05 g·mL-1）中浸泡备用。
1.2.2 固定化酶Chi-GA-CRL的制备
通过改进文献[2，4，8]的方法，在锥形瓶中加入一定量固定化载体，加入一定量酶液和缓冲液，在一定温度下恒温振荡一定时间。固定化结束后，过滤，用蒸馏水洗涤至载体表面无残留游离酶，再用磷酸缓冲液洗涤，抽滤后测固定化酶活力[9-11]。
1.3 酶活力测定
1.3.1 试剂配制 缓冲液：0.05 g·mL-1磷酸缓冲液，pH=7; 底物溶液：4%聚乙烯醇（PVA）溶液与橄榄油以体积比3：1混合，用细胞破碎仪超声30 min充分乳化均匀;终止液：乙醇和丙酮混和溶液（V：V=1：1）;脂肪酶液：用缓冲液充分溶解脂肪酶粉（50 mg/mL）;上清液：固定化后的酶液上清液。
