夏枯草通过HMGB1诱导人胃癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响及其作用机制

段莎，王宗艳

胃癌是一种常见的恶性肿瘤，在2018年有超过100万例新增病例，死亡约78.3万人(相当于全球每12例死亡中有1例)，已成为严重威胁人类健康的第五大癌症，和由癌症引起死亡的第三大原因[1]。预测到2020年，我国胃癌发病率将达到24.30/10万左右，新增病例将达到34.6万左右，其中男性约占23.7万，女性约占10.9万[2]。目前，手术、化疗、放疗等是临床治疗胃癌的主要措施。但由于胃癌细胞的高侵袭性和迁移性，化疗药物的毒副作用，以及患者可能产生的耐药性，导致临床治疗效果欠佳，患者预后不良[3-5]。因此，寻找更加安全有效的治疗方法具有极其重要的现实意义。夏枯草(PrunellavulgarisL.)是唇形科夏枯草属多年生草本植物，以干燥果穗入药，具清肝泻火，明目，散结消肿之功，用于目赤肿痛，目珠夜痛，头痛眩晕，瘰疬，瘿瘤，乳痈，乳癖，乳房胀痛[6]。研究发现，夏枯草注射液可以改善中晚期胃癌患者临床症状[7]，抑制人胃腺癌细胞SGC-7901增殖，并促进其凋亡[8]。但夏枯草对胃癌细胞增殖、迁移等生物行为的影响及其机制尚未阐明。因此，本研究以胃癌细胞BGC-823为研究对象，评价夏枯草在胃癌细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡中的作用，同时观察高迁移率族蛋白B1(High mobility group protein B1, HMGB1)对其治疗作用的影响，旨在阐明相关的分子机制。

1 材料与方法

1.1 夏枯草提取物的制备

夏枯草提取物的制备参照杜宏道等[9]的方法，即用水煮方式提取夏枯草药材，药液过滤后用旋转蒸发仪浓缩，配置成生药质量浓度为1 g/mL夏枯草提取物。之后经灭菌和微孔滤膜过滤，冷藏保存。使用时，用DMEM培养液分别稀释成30 mg/mL、60 mg/mL、90 mg/mL浓度备用。

1.2 实验主要试剂和仪器

胃癌细胞BGC-823购自美国ATCC细胞库；DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；胰酶、RIPA裂解液购自北京索莱宝公司；Lipofectamine 2000购自美国赛默飞世尔有限公司；噻唑蓝(Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)购自美国Sigma-Aldrich公司；pcDNA3.1-HMGB1载体购自广州锐博生物有限公司；细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、P21、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2, Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein, Bax)、基质金属蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase 2，MMP-2)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、HMGB1蛋白抗体购自美国Cellular Signaling Technology公司；辣根过氧化物酶标记二抗购自北京中杉金桥生物技术公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit)购自上海碧云天生物技术研究所；Transwell小室购自美国Corning公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司。细胞培养箱购自美国Thermo公司，酶标仪购自美国Bio-Rad公司，BD FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司。

1.3 细胞培养

BGC-823细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。观察细胞生长状态，待细胞密度达80%，加入胰酶消化，进行传代培养。

1.4 细胞转染

选取处于生长对数期的BGC-823细胞，调整细胞密度为1×105个/mL，加入6孔板。根据Lipofectamine 2000试剂说明书的指示，将pcDNA3.1-HMGB1及相应的阴性对照转染入BGC-823细胞，并用60 mg/mL夏枯草进行处理。培养48 h后，收集细胞用于后续实验。

1.5 噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖

收集生长对数期的BGC-823细胞，将细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔细胞板，细胞贴壁后，分别加入不同浓度(30 mg/mL、60 mg/mL、90 mg/mL)的夏枯草药物，同时以不加夏枯草药物的BGC-823细胞为对照，每组设置6个复孔，在37 ℃、5% CO2的培养箱中分别连续培养24 h、48 h、72 h，弃去原有的培养基，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，37 ℃孵育4 h。弃去MTT溶液，加入150 μL DMSO，37 ℃摇床震荡孵育10 min，在酶标仪上测定BGC-823细胞在波长490 nm处吸光值，计算细胞增殖率抑制率，细胞增殖率抑制率(%)=(1-实验组平均吸光值/对照组平均吸光值)×100%。

1.6 流式细胞仪分析细胞凋亡

在对数生长期的BGC-823细胞中加入60 mg/mL夏枯草药物，同时以不加药物的BGC-823细胞为对照。收集转染后的BGC-823细胞，以转染pcDNA3.1的细胞为对照。调整各组细胞密度为1×106个/mL，根据细胞凋亡试剂盒的说明，使用195 μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC，10 μL PI，轻轻混匀，于室温避光孵育20 min，上流式细胞仪评估细胞凋亡率。

1.7 Transwell小室法检测细胞侵袭和迁移

(1)侵袭实验：收集各组细胞，胰酶消化后制成为5×105个/mL的细胞悬液，吸取100 μL接种于预先用Matrigel胶包被的上室。下室加入含10%胎牛血清的DMEM培养基。置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养48 h，用无菌棉签擦去未穿膜细胞和Matrigel胶，甲醛固定15 min，结晶紫染色20 min，在显微镜下观察，随机选取10个视野，记录侵袭细胞数目。

(2)迁移实验：Transwell上室不铺Matrigel胶，其余步骤同侵袭实验。

1.8 蛋白质印迹法(Western blot)

为检测目的蛋白表达，在各组BGC-823细胞中加入RIPA裂解液，提取总蛋白，后经10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE)，将蛋白转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，用5%脱脂奶粉于常温下封闭1 h，加入一抗，在4℃孵育过夜，随后用Tris-HCl-Tween缓冲盐溶液(Tris buffered saline with Tween, TBST)洗膜10 min，漂洗3次，加入二抗，室温下孵育1 h，TBST洗膜10 min，漂洗3次，加入化学发光液进行显色、显影，以β-actin作为内参蛋白，分析蛋白相对表达量。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 夏枯草对胃癌细胞BGC-823增殖、凋亡的影响

MTT法检测夏枯草对胃癌细胞BGC-823增殖的影响(表1)，与对照组相比，不同浓度夏枯草分别处理BGC-823细胞24 h、48 h、72 h后，细胞增殖抑制率随时间增长、剂量增加呈升高趋势，差异均具有统计学意义(P<0.05)。与夏枯草30 mg/mL组相比，夏枯草60 mg/mL组和90 mg/mL组细胞增殖抑制率在24 h、48 h、72 h逐渐上升，差异均具有统计学意义(P<0.05)。与夏枯草60 mg/mL组相比，夏枯草90 mg/mL组细胞增殖抑制率在24 h、48 h、72 h明显提高，差异均具有统计学意义(P<0.05)。48 h时，夏枯草60 mg/mL组的BGC-823细胞增殖抑制率约为50%，因此选择60 mg/mL夏枯草浓度用作后续实验。

不同浓度夏枯草作用于胃癌细胞BGC-823后，与对照组相比，Cyclin D1蛋白表达明显下降，P21蛋白表达显著升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)。与夏枯草30 mg/mL组相比，夏枯草60 mg/mL组和90 mg/mL组BGC-823细胞中Cyclin D1蛋白表达量显著减少，P21蛋白表达量明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。与夏枯草60 mg/mL组相比，夏枯草90 mg/mL组BGC-823细胞中Cyclin D1蛋白表达水平显著降低，P21蛋白表达明显上升，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1A、表1。

图1夏枯草对胃癌细胞BGC-823增殖、凋亡蛋白表达的影响 A：夏枯草对胃癌细胞BGC-823增殖蛋白表达的影响；B：夏枯草对胃癌细胞BGC-823凋亡的影响；C：夏枯草对胃癌细胞BGC-823凋亡蛋白表达的影响

表1夏枯草对胃癌细胞BGC-823增殖及其相关蛋白表达的影响

注：与对照组比较，aP<0.05；与夏枯草30 mg/mL组比较，bP<0.05；与夏枯草60 mg/mL组比较，cP<0.05

与对照组比较，夏枯草60 mg/mL组明显提高细胞凋亡率和Bax蛋白表达量，显著减少Bcl-2蛋白表达量，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1B、表2。

表2夏枯草对胃癌细胞BGC-823凋亡及其相关蛋白表达的影响

2.2 夏枯草对胃癌细胞BGC-823迁移、侵袭的影响

Transwell小室法对胃癌细胞BGC-823迁移、侵袭的检测结果显示，夏枯草60 mg/mL组迁移细胞数和侵袭细胞数较对照组大幅减少，差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测BGC-823细胞中E-cadherin和MMP-2蛋白表达情况(图2和表3)，发现相比于对照组，夏枯草60 mg/mL组E-cadherin蛋白表达量增加，MMP-2蛋白表达量降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

图2夏枯草对胃癌细胞BGC-823迁移、侵袭蛋白表达的影响 A：夏枯草对胃癌细胞BGC-823迁移、侵袭的影响；B：夏枯草对胃癌细胞BGC-823迁移、侵袭蛋白表达的影响

表3夏枯草对胃癌细胞BGC-823迁移、侵袭的影响

注：与对照组比较，aP<0.05

2.3 夏枯草对胃癌细胞BGC-823中HMGB1表达的影响

Western blot检测结果(图3)显示，夏枯草60 mg/mL组BGC-823细胞中HMGB1蛋白表达水平为0.37±0.03，低于对照组的0.82±0.08，差异具有统计学意义(t=12.901，P<0.001)。

图3Western blot检测HMGB1蛋白表达

2.4 过表达HMGB1能逆转夏枯草对胃癌细胞BGC-823增殖、凋亡的作用

在BGC-823细胞中转染pcDNA3.1-HMGB1载体，并加入夏枯草60 mg/mL进行处理，发现HMGB1蛋白表达量显著高于夏枯草60 mg/mL+pcDNA3.1组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表6，表明转染成功。MTT法检测结果表明，与夏枯草60 mg/mL+pcDNA3.1组相比，过表达HMGB1明显降低60 mg/mL夏枯草处理BGC-823细胞后24 h、48 h和72 h时的细胞增殖抑制率，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表5。此外，过表达HMGB1还减少了BGC-823细胞凋亡率和P21、Bax蛋白表达量，促进P21、Bax蛋白表达，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图4、表4、表5。

2.5 过表达HMGB1能逆转夏枯草对胃癌细胞BGC-823迁移、侵袭的作用

与夏枯草60 mg/mL+pcDNA3.1组比较，过表达HMGB1显著增加夏枯草处理BGC-823细胞后的迁移细胞数和侵袭细胞数，减少E-cadherin蛋白表达量，提升MMP-2蛋白表达水平，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图5、表6。

3 讨论

夏枯草始载于《神农本草经》，作为我国传统中药，距今已有2000多年的药用历史。“此草夏至后即枯”，故名曰夏枯草[10]。夏枯草的活性成分主要有迷迭香酸和咖啡酸等酚酸类成分，芦丁、芸香苷和金丝桃苷等黄酮类成分，熊果酸和齐墩果酸等三萜类成分，以及多糖类成分[11-12]。药理研究表明，夏枯草具有抗肿瘤作用，广泛应用于甲状腺癌、乳腺癌、淋巴癌等的治疗[13-14]。本实验对夏枯草对胃癌中的作用进行研究，发现夏枯草可以抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，并促进其凋亡，作用机制可能与调控HMGB1基因有关。

熊燚等[15-16]的报道指出，夏枯草分别作用于人甲状腺髓样癌TT细胞、人甲状腺乳头状癌K1细胞24 h后，显著减少细胞凋亡率。Yin等[17]的实验显示，夏枯草促进人甲状腺滤泡癌细胞系(FTC-133)凋亡与Bcl-2，Bax和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cysteinyl aspartate specific proteinase 3, Caspase-3)信号通路有关。Zhu等[18]的研究表明，夏枯草可能通过激活促凋亡蛋白Caspase-3，诱导细胞凋亡通路，来抑制肺癌细胞A549生长。夏枯草乙醇提取物具有显著的抗肺癌A549细胞、人乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移的活性[19-20]。本研究中，不同浓度夏枯草处理BGC-823细胞后，显著提高细胞增殖抑制率和P21蛋白表达水平，抑制Cyclin D1蛋白表达，差异均具有统计学意义(P<0.05)。而60 mg/mL夏枯草明显提高细胞凋亡率和Bax、E-cadherin蛋白表达量，显著减少迁移细胞数、侵袭细胞数和Bcl-2、MMP-2蛋白表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。说明夏枯草具有一定的抗胃癌作用，可以抑制胃癌细胞增殖和迁移，并促进胃癌细胞凋亡，这与前述报道相符。另外，夏枯草还显示出了一定的抗侵袭能力。

图4过表达HMGB1能逆转夏枯草对胃癌细胞BGC-823增殖、凋亡蛋白的表达

表4过表达HMGB1能逆转夏枯草对胃癌细胞BGC-823增殖的抑制作用

注：与对照组比较，aP<0.05；与夏枯草60 mg/mL+pcDNA3.1组比较，bP<0.05

表5过表达HMGB1能逆转夏枯草对胃癌细胞BGC-823凋亡的促进作用

注：与对照组比较，aP<0.05；与夏枯草60 mg/mL+pcDNA3.1组比较，bP<0.05

图5过表达HMGB1能逆转夏枯草对胃癌细胞BGC-823迁移、侵袭蛋白表达的影响

表6过表达HMGB1能逆转夏枯草对胃癌细胞BGC-823迁移、侵袭的抑制作用

注：与对照组比较，aP<0.05；与夏枯草60 mg/mL+pcDNA3.1组比较，bP<0.05

本实验中，60 mg/mL夏枯草处理胃癌细胞BGC-823后，HMGB1蛋白表达水平降低，推测调控HMGB1表达可能是夏枯草抗胃癌作用的重要机制。HMGB1属于高迁移率族蛋白(High mobility group protein, HMG)家族，是一种高度保守的核蛋白[21]。在细胞核中，HMGB1维持核内平衡，促进基因转录，几乎在所有真核细胞中都有表达[22]。资料显示，HMGB1在肺癌细胞[23]、胰腺癌[24]、宫颈癌[25]、前列腺癌[26]等癌症进程中发挥着关键作用。miR-505通过调控HMGB1抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[27]。沉默HMGB1表达抑制膀胱癌细胞增殖，而促进细胞凋亡[28]。为了进一步探索夏枯草对胃癌细胞的影响是否通过HMGB1介导，用夏枯草60 mg/mL处理转染pcDNA3.1-HMGB1载体的BGC-823细胞，结果发现，与夏枯草60 mg/mL+pcDNA3.1组相比，过表达HMGB1逆转了夏枯草对胃癌细胞增殖、侵袭、迁移和Cyclin D1、HMGB1、Bcl-2、MMP-2蛋白表达的抑制作用，以及逆转了夏枯草对胃癌细胞凋亡和P21蛋白、Bax蛋白、E-cadherin蛋白表达的促进作用。由此可见夏枯草通过调控HMGB1表达来抑制胃癌细胞增殖、侵袭和迁移，并诱导细胞凋亡。

综上所述，夏枯草能够抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移，并诱导细胞凋亡，其作用机制与调控HMGB1表达有关，这将为夏枯草在胃癌中的应用提供实验依据和参考。