地佐辛对单肺通气后肺损伤的保护作用以及对细胞凋亡、CHOP的影响

李国利，高晓茹，张 悦，王 暐，李福龙，滕金亮

(1河北北方学院附属第一医院麻醉科;2张家口市第四医院麻醉科，河北 张家口 075000)

单肺通气是胸科手术中一种较为常见的机械通气模式，能有效的将患侧肺隔离，避免液体分泌物进入健侧肺，防止患侧肺脏膨胀，为外科医生提供良好的手术视野[1-2]。本方法在胸科临床手术治疗中应用广泛，但也可能导致患者更大程度的肺损伤[3]。呼吸机引起的肺损伤是导致患者术后死亡的重要原因之一，积极合理的干预对改善患者预后、降低死亡率具有重要的意义[4]。目前对单肺通气后肺损伤的机制进行了大量的研究，但尚未形成统一的结论，大部分观点认为，除炎症、氧化应激外，细胞凋亡也是导致肺损伤发生的重要环节[5-6]。CCAAT (一种DNA碱基序列)/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)是内质网应激(ERS)的一个特异转录因子，它在正常细胞中的含量极低，但在ERS状态下会被大量激活，参与细胞凋亡的过程[7]。地佐辛作为一种新型的受体激动-拮抗剂，具有抗炎、清除自由基、抑制细胞凋亡的作用，对缺血缺氧性器官损伤有一定的保护作用[8-9]。本研究采用单肺通气后肺损伤大鼠模型，探究地佐辛对单肺通气后肺损伤的保护作用，分析地佐辛对细胞凋亡及CHOP的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级SD雄性大鼠64只，5～7周龄，体质量(165±35)g，购自中科院上海实验动物中心，动物生产许可证号[SCXK(沪)2017-0006]。大鼠自由饮水、饲以普通的颗粒饲料，饲养条件：温度(22±1)℃，湿度(60%±10%)，12 h照明，12 h黑暗交替环境 。本研究经动物伦理委员会批准(IACUC.20170614005)。

1.2 仪器SMZ-140型光学显微镜(日本Motic公司)，SA926-ALC-V8D 型小动物呼吸机(中国成都泰盟科技有限公司)，1652100型电转移仪(美国Bio-Rad公司)，Elecsys-2010型化学发光仪(罗氏诊断产品有限公司)。

1.3 试药地佐辛(扬子江药业集团有限公司，批号20170218)，苏木素-伊红(HE，北京索莱宝科技有限公司，批号20170500013)，TUNEL试剂盒(德国Roche公司，批号CA1040)，BCA试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号AR0127)，抗兔一抗GRP-78(美国Cell Signaling Technology公司，批号ab58632)，CHOP(美国Cell Signaling Technology公司，批号ab13847)，兔抗GAPDH多克隆IgG抗体(美国Cell Signaling Technology公司，批号ab8226)，羊抗兔多克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司，批号ab97080)。

1.4 实验方法

1.4.1 模型建立与分组方法 取64大鼠颈部正中作一切口，分离出气管并将其切开，将气管导管插入右侧主支气管，连接小动物呼吸机，呼吸机参数设置为：呼吸比为1∶1，吸入氧浓度为100%，48只大鼠做单肺通气，通气频率为60次/min，潮气量为8 mg/kg，16只大鼠做双肺通气，通气频率为60次/min，潮气量为10 mg/kg。沿大鼠两侧第5、6肋观察大鼠肺膨胀及萎陷情况。将48只单肺通气大鼠随机分成3组(n=16)：单肺通气组(O组)、低剂量地佐辛+单肺通气组(L组)和高剂量地佐辛+单肺通气组(H组)，16只双肺通气大鼠为对照组(C组)。L组和H组大鼠分别静脉注射浓度为1.25、2.50 mg/mL的地佐辛生理盐水溶液20 μL，C组和O组大鼠静脉注射生理盐水20 μL。给药2 h后，建立大鼠单肺通气后肺损伤模型，用浓度为10%水合氯醛按4.5 mL/kg体质量腹腔注射对大鼠进行麻醉，取仰卧位将四肢固定。O组、L组和H组大鼠右侧单肺通气1.5 h后行双肺通气0.5 h，C组大鼠双肺通气0.5 h,试验结束后处死各组大鼠。

1.4.2 大鼠肺湿干重比(W/D)计算 取各组大鼠左肺上叶，用预冷的生理盐水漂洗，洗去血液后用滤纸吸干多余水分，称重即为湿重(W),于50℃下烘干48 h再次称重，即为干重(D),两者的比值 W/D为肺湿干重比。

1.4.4 大鼠肺组织形态学评价 将各组大鼠左肺下叶组织切块后置入浓度10%的中性甲醛溶液固定2 h后，行常规石蜡包埋，切片厚度4～5 μm，采用HE染色，光学显微镜下观察大鼠中性粒细胞浸润、出血，肺泡充血、水肿、厚度、完整性及透明膜形成等情况，由两位经验丰富的病理学专家对病理结果进行评估。

1.4.5 大鼠肺组织细胞凋亡检测方法 取大鼠左肺下叶组织，按TUNEL试剂盒说明书操作，检测大鼠肺组织细胞凋亡情况。在光学显微镜下(×400)对凋亡细胞进行计数，凋亡细胞核染色呈棕褐色，未凋亡细胞核染色呈蓝紫色，每张切片至少观察500个细胞，观察5张切片，计算每100个细胞内的凋亡细胞数，计算凋亡指数(AI)=凋亡细胞数/细胞计数×100%。

1.4.6 大鼠肺组织GRP-78及CHOP蛋白的测定方法 取大鼠左肺上叶组织100 mg，加入组织裂解液，4℃下后取上清液，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。取4 μL蛋白样品为上样量，加样于10%的SDS-PAGE中，在电压80 V的条件下电泳，按分子量大小分开蛋白质，在电压20V的条件下电转移30min，将半干燥条件下的蛋白样品转移到PVDF膜上，洗膜，用5%脱脂奶粉封闭2 h。加入GRP-78、CHOP兔抗(1∶1 000)和兔抗GAPDH多克隆IgG抗体(1∶1 000)，4℃孵育过夜，洗涤，复温后用1∶500羊抗兔二抗孵育0.5 h。采用罗氏Elecsys-2010化学发光仪观察并记录结果，蛋白表达水平根据GAPDH进行标化，通过Image J软件进行灰度扫描、定量。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织的W/D比值和AI比较与C组比较，O组的W/D和AI值 升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与O组比较，L组和H组的W/D和AI值下降，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 各组大鼠肺组织的W/D比值和AI比较±s，n=10)

2.2 肺组织的形态学变化C组大鼠肺组织病理未见明显的改变，肺组织结构完整清晰，肺泡正常间质未见明显的炎症浸润或水肿；O组大鼠表现为严重的病理生理变化，包括肺泡萎陷，肺泡壁增厚，肺泡严重弥漫性水肿和间质空间，透明膜的形成，红细胞的浸润，出血，以及肺实质中中性粒细胞和巨噬细胞的大量浸润。在L组和H组中大鼠肺组织病理生理学改变减弱,见图1。

图1 各组大鼠肺组织的形态学变化图(× 400)

2.3 GRP-78及CHOP蛋白的表达与C组比较，O组大鼠GRP-78、CHOP蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与O组比较，L组和H组大鼠GRP-78和CHOP蛋白水平下降，差异有统计学意义(P<0.01)；与L组比较，H组大鼠GRP-78和CHOP蛋白水平下降，差异有统计学意义(P<0.01)，见图2-4。

图2 各组大鼠肺组织中GRP-78和CHOP蛋白电泳图

图4 各组大鼠肺组织中CHOP蛋白相对表达水平图(注：与C组比较，aP<0.01；与O组比较，bP<0.01；与L组比较，cP<0.01)

3 讨论

胸外科手术麻醉患者在进行单肺通气的过程中，非通气侧肺会经历一个萎陷后再复张过程，导致其发生损伤[11]。如何在最大程度发挥单肺通气优点的前提下，尽量减少其对肺脏的损伤是目前胸外科领域研究的重点[12]。本研究建立了单肺通气诱导大鼠肺损伤模型，探究了地佐辛预处理对降低肺损伤的作用以及可能的机制。肺组织W/D比值被认为是反映肺组织水肿情况的重要指标，本研究的结果显示，与C组比较，O组大鼠的W/D比值明显的升高。其次，O组大鼠的AI也明显的高于C组；电镜下O组大鼠的肺组织病理学发生了改变，损伤也最严重。表明单肺通气诱导大鼠肺损伤模型成功制备。地佐辛能够改善单肺通气大鼠肺水肿以及病理损伤程度。证明地佐辛对单肺通气肺损伤大鼠具有保护作用。

细胞凋亡已经被证实在急性肺损伤的发生、发展中具有重要的作用[13-14]。ERS 是细胞凋亡的途径之一。ERS相关通路近年来被认为是一种新型的用于治疗急性肺损伤的靶点[15]。GRP78是内质网上一种重要的内质网伴侣蛋白，它在非应激状态下处于无活性[16]。当机体处于应激状态时，作为一种生存机制，GRP78会与3 种内质网跨膜蛋白肌醇需要酶1α(IRE1α)、RNA依赖蛋白激酶样ER激酶(PERK)和活化转录因子6(ATF6)解离，介导与未折叠蛋白或错误折叠蛋白发生反应，从而调节ERS相关跨膜信号感受器的活性，维持内环境的稳定[17]。在这一过程中，未折叠蛋白反应可以对机体起到保护作用，而过度的未折叠蛋白反应则会诱导ERS相关性细胞凋亡[18]。若ERS长时间过度存在则会激活转录因子4(ATF4)持续表达促使编码细胞凋亡的诱导因子，从而上调CHOP的表达水平，进一步诱导氧自由基，促进细胞凋亡[19-20]。本研究结果显示，单肺通气上调了GRP78和CHOP蛋白的表达，而地佐辛预处理可以使GRP78和CHOP蛋白的表达下调，并且高剂量地佐辛预处理的下调程度要高于低剂量组。结合细胞凋亡率检测，两者的结果是一致的。表明地佐辛能够通过抑制ERS，减少细胞凋亡，减轻单肺通气诱导的肺损伤。地佐辛作为一种阿片受体的激动-拮抗剂，可以促进肾上腺分泌皮质醇来应对机体应激反应，降低机体炎症因子和细胞因子的释放，促进单肺通气肺损伤后肺组织细胞内蛋白质的正确折叠或纠正蛋白质的错误折叠，减轻过度的未折叠蛋白反应，从而抑制ERS诱导的细胞凋亡。本研究通过大鼠单肺通气后肺损伤模型，发现地佐辛预处理对大鼠单肺通气诱导的肺损伤具有一定的保护作用，其机制可能与下调ERS 状态下CHOP的表达，抑制细胞凋亡有关。