PIK3CA基因突变与HER-2表达及基因扩增在乳腺癌中的相关性

王翠翠,曹燕珍,梁莉萍,胡佳捷,李鸿涛

(新疆医科大学附属肿瘤医院1病理科，2乳腺头颈外科，乌鲁木齐 830011)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)过度表达的乳腺癌患者预后相对较差。虽然HER-2过表达的患者可以从曲妥珠单抗靶向治疗中获益，但即使与化疗药物合用，总有效率始终<40%[1]，提示HER-2过度表达的乳腺癌患者具有异质性，但其潜在原因尚不清楚。PI3K/Akt信号通路是HER-2下游的信号转导通路，研究显示PI3K/Akt信号通路控制着肿瘤细胞凋亡、血管新生、细胞周期及多药耐药等生物学过程，其信号通路中的PIK3CA突变与乳腺癌的耐药相关[2]，临床回顾性分析发现PIK3CA基因突变的乳腺癌患者，从赫赛汀的治疗中获益较少，部分研究者已观察到乳腺癌中PIK3CA基因突变与HER-2蛋白表达及基因扩增的关系，但结论尚不一致[3-5]。PIK3CA基因突变与HER-2表达之间的内在联系有待于进一步研究，本文采用免疫组织化学染色方法(immunochemistry，IHC)和荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)方法，检测HER-2蛋白表达及基因扩增状况，用荧光PCR方法检测PIK3CA基因第9号外显子及第20号外显子，分析PIK3CA基因突变、HER-2蛋白表达及基因扩增与临床病理特征之间的相关性，进一步探讨PIK3CA基因和HER-2基因扩增在乳腺癌发生发展过程中可能的作用及相关性，为本地区乳腺癌患者的个体化诊疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 临床病理资料收集新疆医科大学附属肿瘤医院2012年1月-2014年12月行FISH检测乳腺浸润性导管癌患者128例，患者年龄23～80岁，平均年龄49岁，所有病例均经病理确诊，免疫组织化学染色结果、淋巴结转移情况及组织学分级均经病理科两位医师判读。

1.2 主要仪器试剂雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、Ki-67(克隆号EP1、EP2、EP5)试剂购自北京中杉金桥生物有限公司，Her-2试剂(克隆号4B5)购自Roche(美国)，均为兔单克隆抗体；二抗试剂盒、DAB显示试剂盒均购自Roche(美国)，免疫组织化学采用BenchMark XT全自动染色系统(美国罗氏)。FISH试剂盒购自雅培Vysis(美国)的PathVysion HER-2 DAN probe kit，DNA提取试剂盒(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit)购自德国QIAGEN公司，PIK3CA基因突变检测试剂使用北京雅康博生物有限公司(人PIK3CA基因突变检测试剂盒)。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学结果判读 根据《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范(2017版)》[6]、中国《乳腺癌HER-2检测指南(2014版)》[7]，ER及PR肿瘤细胞核染色数≥1%判定为阳性；Ki-67肿瘤细胞核染色数≥20%为高表达，<20%为低表达；HER-2判读标准0：无染色或≤10%的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞膜染色；1+：>10%的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞膜染色；2+：有两种情况，第一种为>10%的浸润癌细胞呈现不完整和/或弱至中等强度的细胞膜染色，第二种为≤10%的浸润癌细胞呈现强而完整的细胞膜染色；3+：>10%的浸润癌细胞呈现强而完整的细胞膜染色。0和1+为HER-2阴性，3+为HER-2过表达。以HER-2(2+)及(3+)者继续行FISH检测，了解有无基因扩增。

1.3.2 FISH检测结果判读 判读标准参照《乳腺癌HER-2检测指南(2014版)》[7]，HER2/CEP17比值<2.0且平均HER-2拷贝数/细胞<4.0为无HER-2基因扩增；比值≥2.0或比值<2.0且平均HER-2拷贝数/细胞≥6为HER-2基因有扩增。

1.3.3 PIK3CA基因突变检测 样本均使用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋组织，3～5 μm制成切片，并选择肿瘤富集区域，提取DNA。检测方法为实时荧光定量PCR方法，待测DNA样品中基因突变情况评判：若样品中某突变位点检测有扩增且Ct值≤35，则判定该样本突变结果为阳性；若Ct值>38或无扩增，则判定该样本突变结果为阴性；若35

1.4 统计学处理运用SPSS 19.0软件进行统计学处理，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FISH结果分析128例乳腺癌中有71例为HER-2基因扩增，57例无扩增，HER-2基因未扩增和扩增图，见图1、图2。

图1 HER-2基因未扩增

图2 HER-2基因扩增

2.2 PIK3CA基因突变结果分析128例乳腺癌中有47例检测到了PIK3CA基因突变，突变率为35.9%，其中第9号外显子突变有15例，突变率为31.9%，第20号外显子突变有32例，突变率为68.1%。PIK3CA基因突变未突变及突变图,见图3、图4。PIK3CA基因突变与临床分期具有相关性(P<0.05)，与年龄、肿瘤大小、淋巴结有无转移、组织学分级及ER、PR、Ki-67、HER2无关(P>0.05)，见表1。

图3 PIK3CA基因未突变

图4 PIK3CA基因突变(20号外显子突变)

表1 乳腺癌中PIK3CA基因突变与临床病理特征的关系/例(%)

2.3 PIK3CA基因突变与HER-2基因扩增的关系71例HER-2扩增组中有27例检测到PIK3CA基因突变，57例未扩增组中有20例检测到PIK3CA基因突变，突变率分别为38%和35%，统计学分析显示，HER-2基因扩增组中PIK3CA基因突变与组织学分级有关(P<0.05)，与ER的表达有关(P<0.05)。在HER-2扩增组和非扩增组中，PIK3CA基因突变均与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期、PR及Ki-67无关(P>0.05)，但在HER-2扩增组中，14例组织学Ⅲ级的乳腺癌PIK3CA基因突变者10例，PIK3CA基因突变比例高于组织学Ⅰ级(0例)和Ⅱ级(57例中有17例突变)；在HER-2未扩增组中，无淋巴结转移患者的PIK3CA基因突变率较有淋巴结转移患者高，见表2。

表2 HER-2扩增组和未扩增组中PIK3CA突变情况/例(%)

3 讨论

乳腺癌是一种异质性疾病，它的发生是多级别、多步骤过程。PI3K/Akt信号转导通路是细胞内一条重要的信号传导途径，在乳腺癌，HER-2过表达可以导致 PI3K /Akt 信号通路的激活，其异常激活与乳腺癌发生、发展密切相关，而抑制该通路活性对于乳腺癌治疗有着十分重要的意义[8]。PIK3CA基因是PI3K通路中重要的原癌基因，而乳腺癌的治疗与ER、PR、Ki-67、HER2的表达密切相关，研究它们之间的相关性对乳腺癌的治疗及预后有重要意义。

本研究检测了128例散发性乳腺癌组织中PIK3CA基因突变情况，突变率为35.9%，文献报道在乳腺癌中PIK3CA基因突变率为15.6%～40.4%[5,9]。突变率不同可能与所选所选病例中乳腺癌分子分型所占比例不同有关，有研究表明其在 Luminal A 和 Luminal B 中突变率分别为46%和31% ，而在三阴性乳腺癌中仅为9%[10]，因此推测PIK3CA 基因在 Luminal 型乳腺癌中最易发生突变，本组病例中Luminal 型乳腺癌所占比例较大。本研究中PIK3CA基因突变与乳腺癌的临床分期有关，Ⅲ期和Ⅳ期的患者PIK3CA基因突变率较高，提示PIK3CA基因突变与患者的临床预后有相关性。这与Bai等[11]研究结果相似，提示PIK3CA基因可作为提示乳腺癌预后的候选基因。

HER-2过表达能够激活下游众多信号分子，PI3K/Akt是其中之一。在乳腺癌，HER-2过表达可以导致PI3K/Akt/mTOR通路的激活，而Akt及下游信号的激活能够抑制细胞周期的停滞和破坏曲妥珠单抗介导的细胞凋亡。在HER-2过表达型乳腺癌中，PTEN表达的缺失及 PIK3CA突变被认为是 PI3K通路激活的标志，二者均有助于曲妥珠单抗耐药发生[12]。本研究显示，HER-2基因扩增组中PIK3CA基因突变与组织学分级相关，与ER的表达相关，HER-2未扩增组中PIK3CA基因突变与淋巴结转移有关。本组病例中乳腺癌PIK3CA基因突变与HER-2基因状态无相关性，但在HER-2扩增组中，组织学Ⅲ级的乳腺癌较组织学Ⅰ级和Ⅱ级的PIK3CA基因突变率高，提示在HER-2过表达的患者中PIK3CA基因突变可能与肿瘤分化具有相关性；在HER-2未扩增组中，无淋巴结转移患者的PIK3CA基因突变率较有淋巴结转移患者高，提示HER-2基因未扩增患者中PIK3CA基因突变与乳腺癌转移可能具有相关性。

综上，PIK3CA基因突变与患者的临床预后有相关性，PIK3CA基因可作为提示乳腺癌预后的候选基因，PIK3CA基因突变与HER-2基因扩增组和非扩增组的临床病理特征具有一定的相关性。PI3K-Akt-mTOR信号通路抑制剂在乳腺癌患者曲妥珠单抗使用中可能具有积极的作用，PIK3CA基因及其相关信号通路与HER-2的相关性有待更深入的研究。