免疫亲和柱在果蔬有机磷农药残留测定前处理中的应用研究

杨 柳，朱杰丽，柴振林，尚素微，吴翠蓉，蒋步云，方 燕

（浙江省林产品质量检测站，浙江 杭州 310023）

目前有关水果、蔬菜中有机磷农药残留检测的前处理方法报道较多，并主要体现在提取液配置及提取后的净化处理上[1-2]。其中应用最为广泛的是NY/T 761-2008《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》[3]，方法规定有机磷农药提取试剂为乙腈，而后提取液经旋干、丙酮定容后待上仪器测定，该方法具有普适性。但由于对提取液的净化效率较为低下，更适合样品本底较少、背景较为干净的样品，而对一些提取液颜色深或本底成份复杂的样品不适用。主要体现在这些样品在进样时造成了对检测设备的极大污染，以致仪器灵敏度下降，特别是对一些极性较强的有机磷如甲胺磷、久效磷、氧化乐果等下降幅度更大，这样不仅增大了方法的检出限，还会对仪器部件如进样口配件、色谱柱等造成极大损耗，甚至缩短仪器寿命[4]。

鉴于此，有人通过改变提取液极性或增加净化步骤来加以改善。欧阳蒲月[5]等采用二氯甲烷、丙酮混合提取液提取蔬菜中有机磷；宋国新[6]采用混合提取液，由乙腈25%、丙酮25%、乙醚25%、二氯甲烷25%按体积百分比组成，在后续试验中增加了氨基柱净化步骤并引入甲苯作为洗脱液提取测定豇豆中农药残留。Huang[7]等采用凝胶渗透色谱法及固相萃取法提取茶叶中多种有机磷农药。这些改进均对NY/T 761-2008 进行了延伸和拓展，使有机磷检测技术得到了极大提升。但这些改进方案，如混合提取液虽能提高各种农药的提取效率，但同时也增加了对非目标物的提取量，而这些非目标物必然是检测方法的累赘。各种固相萃取净化小柱的应用势必额外增加有机试剂的用量，增加对环境的污染，同时增加方法应用步骤，增大检测劳动量。

本实验发现一种多功能的免疫亲和柱（MycoSep 226 AflaZon+）可直接应用于水果、蔬菜有机磷农药残留检测中净化有机磷的乙腈提取液。免疫亲和柱是一种特殊的SPE 柱，以极性、非极性及离子交换等几类基团组成填充剂，可选择性吸附样液中的脂类、蛋白类等杂质，现主要被用于黄曲霉毒素含量测定的前处理净化过程中[8-9]。应用该柱对果蔬中有机磷农药残留提取液进行净化处理，可有效去除脂类、蛋白类等杂质，有机磷农药则可顺利通过。该方法净化速度快，省时省力，有望在今后农药残留测定中广泛应用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用杨梅Myrica rubra，黄瓜Cucumis sativus，辣椒Capsicum annuum鲜样各5 kg，均来源于浙江省杭州市西湖区留下镇世纪联华超市。

1.2 仪器设备与试剂

仪器设备：气相色谱仪（Agilent 6890N）配火焰光度检测器（FPD），HP-5MS 5% Phenyl Methyl Silox (30 m×0.25 mm，0.25 μm)，磨样机（九阳 JYL-C022E），高速分散机(IKA T18 basic)，免疫亲和柱（MycoSep 226 AflaZon+），具塞量筒（100 mL），计时器。

试剂：乙腈（分析纯），氯化钠（分析纯），丙酮（优级纯），有机磷农药标准溶液（上海安谱科技有限公司）：敌敌畏、丙溴磷、乙酰甲胺磷、治螟磷、甲拌磷、氧化乐果、二嗪磷、久效磷、除线磷、乐果、皮蝇磷、对硫磷、倍硫磷、异柳磷、水胺硫磷、喹硫磷、杀扑磷、乙硫磷、硫环磷，浓度均为1 000 μg·mL-1，使用时用丙酮将其配制成相应浓度混表。

1.3 色谱条件

1.4 样品制备及提取、净化

用磨样机将样品鲜样粉碎，称取25.00 g 至150 mL 烧杯中，加入50 mL 乙腈，在高度分散机上分散萃取2 min（10 000 r·min-1），过滤，将滤液收集到装有7 g NaCl 的10 mL 具塞量筒中，盖上塞子，剧烈振荡1 min 后，静止30 min，吸取上清液过免疫亲和柱净化，收集净化液0.5 mL 于进样瓶中，待测。

1.5 不同净化处理方式处理结果比较

分别向3 种样品中添加含量为0.2 mg·kg-1浓度的上述混合标样，按照NY/T 761-2008 中有机磷农药残留前处理的净化方式和过免疫亲和柱净化方式对样品进行前处理，以目标物的检出限高低、对仪器的污染程度及处理时间作为评价依据，对其净化处理效果进行比较。

1.6 精密度与检出限

分别在杨梅、黄瓜、辣椒样品中添加浓度为0.02 mg·kg-1，0.05 mg·kg-1，0.10 mg·kg-1有机磷农药混标，按照1.4，1.3 的方法进提取、检测，测定其精密度检出限，各处理均6 次重复。

1.7 数据分析

采用Excel97-2003 软件进行分析处理数据，安捷伦气相色谱工作站Chemistation 软件生成图。

2 结果与分析

2.1 校准曲线绘制

用杨梅基质提取液将混合标准溶液配制成0.02～ 1.00 mg·L-1的标液在优化选择的色谱条件下进行分析，获得混标色谱图，如图1。图1 中，19 种浓度为0.10 mg L-1的混合标液色谱图，谱图基线平稳，杂质干扰小，不影响目标物定性分析。以化合物的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线（表1），各种有机磷农药在该范围内均有良好的线性关系，相关系数（r2）均大于0.999。黄瓜、辣椒的校准曲线与之相近。

图1 浓度为0.10 mg·L-1 的19 种混合标样色谱图Figure 1 Chromatograms of 19 mixed standard solution with concentration of 0.10 mg·L-1

表1 19 种有机磷农药的线性范围、回归方程及相关系数Table 1 Linear range,regression equation and correlation coefficient of 19 organophosphorus pesticides

2.2 不同净化处理方式结果比较

分别向三种样品中添加含量为0.20 mg·kg-1浓度的上述混合标样，按照NY/T 761-2008 中有机磷农药残留前处理的净化方式和过免疫亲和柱净化方式对样品进行前处理，以目标物的检出限高低、对仪器的污染程度及处理时间作为评价依据，对其净化处理效果进行比较。各处理测定结果如表2。由表2 可知，所有农药的平均含量为0.18 mg·kg-1，标准差为0.002 7 mg·kg-1，免疫亲和柱处理的则为0.19 mg·kg-1，0.001 6 mg·kg-1。经NY/T 761-2008 的处理的3 种样品经过20 次进样后色谱仪中进样隔垫、衬管、分流平板等均有明显污渍，色谱柱接进样口端色泽变化明显，且目标峰峰高呈逐渐缩小趋势，而采用免疫亲和柱处理的样品则无这些现象。NY/T 761-2008 的净化处理过程约2 h，而免疫亲和柱的则只需要1 min。可见采用免疫亲和柱对果蔬中有机磷残留测定进行净化处理效果及测定结果准确度明显优于NY/T 761-2008，而且平行性良好，既省时省力，又能够有效保护检测设备。

表2 不同净化方式样品进样20 次的测定结果Table 2 Result of 20 tests on samples purified by different methods

2.3 精密度与检出限

分别在杨梅、黄瓜、辣椒样品中添加浓度为0.02 mg·kg-1，0.05 mg·kg-1，0.10 mg·kg-1有机磷农药混标，按照1.4，1.3 的方法进提取、检测，测定其精密度、检出限，各处理均6 次重复。

表3 19 种有机磷农药的检出限及精密度Table 3 Detection limit and precision of 19 organophosphorus pesticides

根据峰面积与标准曲线计算浓度值并计算相对标准偏差，以此考察方法的精密度。19 种有机磷农药的相对标准偏差（RSD）在1.6%～ 4.8%，检出限均在0.01 mg·kg-1以下，如表3。由表3 可知，实验中低浓度添加水平（0.02 mg·kg-1）回收率在85.4%～ 96.1%，中浓度（0.05 mg·kg-1）在89.7%～ 97.1%，高浓度（0.10 mg·kg-1）在90.2%～ 103%，总体回收率均在85%以上，可满足当前果蔬中有机磷农药残留测定要求。

3 结论与讨论

在NY/T 761-2008 标准的基础上，本试验采用多功能免疫亲和柱对有果蔬中机磷农药提取液进行净化，建立了一种可快速净化果蔬中有机磷农药残留的方法。19 种有机磷农药不同浓度回收率中，低浓度添加水平（0.02 mg·kg-1）回收率在85.4%～ 96.1%，中浓度（0.05 mg·kg-1）在89.7%～ 97.1%，高浓度（0.10 mg·kg-1）在90.2%～103%，总体回收率均在85%以上，RSD 在1.6%～ 4.8%范围内，检出限均在0.01 mg·kg-1以下，明显优于NY/T 761-2008 的规定方法。本方法净化过程可在1 min 内钟完成，净化液可直接用于测定，方便、快捷，并可明显降低对检测设备的污染程度，这与刘艺[10]等对宣木瓜中有机氯农药处理效果相近。可见，本方法可满足当前果蔬中有机磷农药残留测定要求，有望在今后农药残留测定中广泛应用。