百脉根分子生物学主要领域研究进展

李宗英，王 丹，边佳辉，孙占敏，傅 华，吕嘉卫，吴燕民

（1. 兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020；2. 中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081；3. 上海金柯劳沃生物科技有限公司，上海 200000）

百脉根(Lotus corniculatus)，多年生丛生草本植物，隶属于豆科(Leguminosae)百脉根属，别名五叶草、牛角花、都草、鸟距草[1-4]。我国百脉根属共有9种(包括1个变种)，主要产自于西北地区，分别为翅荚百脉根、兰屿百脉根、百脉根、高原百脉根、新疆百脉根、细叶百脉根、尖齿百脉根、短果百脉根，变种为光叶百脉根。

百脉根多呈匍匐或半匍匐型生长，分枝众多；叶片为掌状三出叶，小叶卵圆形或倒卵形[5]；花为伞状花序，花期长，花量大[6]。百脉根对土壤环境要求较低，能在高纬度及寒冷干旱地区生长且适应性良好，在裸露坡地种植进行边坡防护时具有良好的水土保持性能[7-8]；百脉根种植简便，种子可落地自生，自行繁衍能力强，是建立栽培草地以及改良放牧草地的优良种质资源[9]。百脉根枝叶柔嫩，营养丰富，干物质消化率高，适口性好，各类家畜均喜食，且百脉根茎叶富含缩合单宁，能够有效降低反刍动物发生臌胀病的几率，是极好的牧草和饲料[10]。由于百脉根种子细小、出苗能力弱、幼苗喜潮湿、与杂草竞争力差等，导致实际生产尚未得以大面积推广应用；但近年来随着分子生物学应用于多个领域，利用生物技术方法改良百脉根种质资源，揭示百脉根根瘤固氮机理，不仅能够加快其应用于畜牧生产业的进度，对草原生态环境的改良也有深远的影响。因此，对百脉根的主要研究方向包括遗传多样性与系统进化分析、抗逆境胁迫、抗除草剂、根瘤固氮、缩合单宁、作为生物反应器以及药理学应用共7个方面进行综述，对研究过程中存在的不足之处进行探讨，并对其应用前景进行了展望，以期加强百脉根在草业生产实践中的资源配置。

1 百脉根遗传多样性与系统进化分析

百脉根原产于地中海盆地、欧洲和中非部分地区，生态范围广泛，与物种的多态性特征遥遥呼应；现于世界各地包括欧洲、温带地区的小亚细亚、北非、美国及我国均有分布[11]。百脉根对不同生境条件的适应性导致其形态、生物学特性和农艺性状发生了变异，形成了众多的生态类型。研究发现：高海拔地区大多数百脉根种群趋于产生开花晚的半匍匐型植物，而随着海拔的降低，百脉根茎数、节间数和茎长逐渐增加[12-13]。为提高百脉根利用效率，Kramina等[14]对百脉根的种质育种方面展开了分析，通过比较两个百脉根种群经自交和多向杂交后代的存活率与种子产量发现，多向杂交后代的存活率高于自交后代，并且多向杂交产生的豆荚大小以及豆荚内种子数均优于自交后的豆荚大小及豆荚内种子数；而使用基因型不同的2个品种与27个异源百脉根品系进行杂交并对F1代的活力、花粉萌发、豆荚长度及每个豆荚产生种子数进行分析发现：基因型的杂交能力与采集地点的生态地理特征有关，但与形态特征无关。

小学阶段的学生对新事物充满好奇，对生活的一切都有着较大的探索兴致。因此，教师在开展思想品德教育时，要为学生创造既丰富又熟悉的教学情境，将课堂教学内容和学生的衣食住行联系起来，真正引导其意识到思想品德课程的重要性。例如，教师在讲解《互帮互助一家亲》的章节内容时，可以先请学生回忆自己和家人一起合作完成的某件事，然后再将学生分成若干人一组，通过游戏比赛的形式让学生体会团结协作的重要性，在促进学生与学生之间感情的同时提升教学效率和质量。

好啦孙滑头，现在的关键是你马上去牛皮糖那里，想办法请他出院，不管用什么办法，总之今天就让他出来。否则我扣你的工资。

②建设农田过滤带。选择设施农业大棚区北侧的1号渠，沿渠道北侧布置600 m的农田过滤带，采用截流沟、植被过滤带等6种不同的配置模式（见表1），降低农田径流污染物浓度，减少入河污染物。

百脉根作为医学上重要的植物，亦可用于草药制剂。百脉根的花可用作抗痉挛与镇静剂，根可用作驱风剂以及退热药[46]。Salman对收集的百脉植物营养元素进行定性和定量测定，发现根系含有多种植物化学物质，包括生物碱、类固醇、皂苷、鞣酸、还原糖、蒽醌、蒽醌苷、碳水化合物和蛋白质等；茎存在生物碱、单宁、皂苷、类黄酮、类固醇、还原糖、蒽醌和萜类化合物；叶片含有生物碱、单宁、皂苷、类固醇和还原糖；说明百脉根植物化学成分较为丰富，其中叶茎中重要的植物化学成分较多。进一步研究百脉根提取物对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的抗菌活性，发现金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌和肺炎球菌的活性均受到抑制(大肠杆菌、伤寒沙门氏菌和肺炎球菌是引起胃病，肠道和肺部炎症的主要原因)，而铜绿假单胞菌则不受影响[47-48]。从百脉根种子分离的凝集素对人体白血病细胞系(THP-1)和肺癌细胞系(HOP62)和结肠癌细胞系(HCT116)的增殖有相当大的抑制作用，对THP-1细胞进一步研究发现，随着凝集素浓度的增加，THP-1细胞的细胞周期发生显著改变，表明LCL诱导THP-1细胞凋亡，通过形态学观察结果显示，百脉根凝集素处理的THP-1细胞表现出明显的细胞凋亡特征，如核碎裂，染色质浓缩和线粒体膜电位的丧失等[49]。百脉根还可以通过抑制白细胞流入和渗出物浓度而呈现出极为重要的抗炎作用[50]以及抗胃肠线虫的保健食品的作用[40]。

必修3统计章节包含抽样方法（简单随机抽样、系统抽样、分层抽样）、总体分布的估计（频率分布表、频率分布直方图与折线图、茎叶图）、总体特征数的估计（平均数及其估计、方差与标准差）、线性回归方程．选修2-3章节包含独立性检验（统计量）、回归分析（随机误差、线性回归模型、相关系数）．

对百脉根的资源评价应用方面也有相应研究。如，对里奥、迈瑞伯以及早熟品系的农艺性状、越冬率及生长速率等指标进行评价发现，早熟品系的生长速率、产草量皆显著高于其他两个品系[20]；通过对21份百脉根种质材料的抗旱性进行综合评定，发现干旱条件对百脉根种子萌发具有显著的抑制作用[21]，并从当中筛选出7份抗旱性较强的百脉根材料[22]；陈超等[23]对8份百脉根材料的生理生态指标进行分析，为百脉根材料的筛选提供了理论依据；张本瑜和师尚礼[24]以3份中国百脉根材料作为对照，研究了73份俄罗斯百脉根的营养指标和饲喂价值，筛选出13份价值较高的百脉根材料，为百脉根遗传育种与推广种植提供了依据；Hunt等[25]对美国爱达荷州南部和犹他州北部的5个商业有机奶牛场建立的百脉根牧场进行评估，证明了利用百脉根构建人工牧场的可实行性。

建筑工程设计工作是影响工程造价的主要因素，体现在设计人员与图纸方面。对于设计人员，如果专业素质不能达到标准，没有掌握先进技能与专业基础，在设计期间很容易影响工程造价，无法将工程造价控制与施工设计联系在一起。施工设计图会直接影响工程成本，如果不能在施工前期进行设计图纸的审核与完善，在施工中很容易出现变更现象，不利于进行造价的管理与控制，难以形成良好的发展体系。

2 百脉根的生物学特性研究

2.1 共生固氮

豆科植物能够分泌一种类黄酮化合物或相关化合物，此类化合物通过诱导结瘤基因的表达，从而产生能够分泌根瘤菌的信号分子-结瘤因子。同时，结瘤因子会反作用于豆科植物刺激根瘤发育相关基因的表达，直至成功的在寄主植物根部形成根瘤。

从百脉根中相继克隆得到NIN[26]、SymPK[27]、NFR1和NFR5[28]、NUP133[29]和NUP85[30]以及CCa-MK[31]等基因。其中，结瘤起始基因NIN的主要功能是调控根瘤发育中下游基因的表达；激酶受体基因SymPK是感知微生物信号分子到快速启动共生关联基因的共生信号转导途径所必需的；NFR1和NFR5是一种含有LysM结构域结瘤因子受体蛋白激酶，它们主要参与并传递结瘤因子信号；NUP133和NUP85基因在百脉根中的核质信息交流过程中起作用；CCaMK作为钙调素依赖性蛋白激酶，当钙调素结合位点缺失或自磷酸化位点突变，会导致百脉根在无根瘤菌条件下，形成自发根瘤或者与结瘤相关基因的表达。此外还有许多基因(表1)同样参与百脉根结瘤因子感知和随后的共生信号转导、根瘤侵入线的形成以及结节器官发生等过程。

激素在百脉根结瘤中起到了重要的调控作用。其中生长素(IAA)、细胞分裂素(CTK)、赤霉素(GA)作为正调节因子在百脉根根瘤形成过程中发挥功能，而茉莉酸(JA)、水杨酸、脱落酸(ABA)和乙烯作为负调节因子抑制百脉根的结瘤。百脉根还存在结瘤自主调节机制(AON)，通过根-茎之间的长距离信号来控制结瘤数目。百脉根AON的缺陷突变体Har1可以在除茎顶端外的多种器官内广泛表达，主要接受来自于根部的信号继而在茎中产生结瘤抑制因子来抑制结瘤。此外KLA(KLAVIER)也是百脉根AON中不可缺少的一环，和Har1在遗传途径中行使相同的功能。除了AON表现出的内部信号，外界环境刺激也能够影响百脉根的结瘤：对百脉根根部进行强烈的光照能够有效抑制结瘤，但将百脉根突变体astray置于强光的照射下，结瘤正常发生[32]。研究有机肥和无机肥对百脉根结瘤活性的影响发现，当施用有机肥料时百脉根的根系数目会显著增加，但会抑制百脉根结瘤，而施用硝酸钾、复合肥料或过磷酸盐处理百脉根时，其根部的结瘤数增加了两倍[33-34]。也有学者发现，利用发根农杆菌侵染植物的伤口部位，体外生根培养后接种根瘤菌，在转化植株上形成的根瘤具较高的固氮酶活性[35]。使用发根农杆菌将完整的大豆血红蛋白Lbc3基因转移到豆科植物百脉根中，根瘤菌感染后，在再生的转基因百脉根上形成的根瘤中观察到Lbc3基因的特异性表达[36]。

采用SPSS 19.0软件对数据进行分析处理，计量资料以（均数±标准差）表示，采用t检验；计数资料以（n，%）表示，采用χ2检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2.2 缩合单宁

2.2.3 缩合单宁对动物生产的影响

遗传和环境变量是影响百脉根中缩合单宁含量的主要因素。一般来说，在不同生长阶段以及不同器官内缩合单宁含量有所差异，其浓度会随着百脉根的成熟度增加而增加，并且与组织中木质素的含量正相关[37-38]。缩合单宁含量与土壤中的营养成分息息相关，湿地百脉根(L. uliginosus)中缩合单宁(CT)含量会随着有效磷和有效硫含量的增加而增加，但是在百脉根中却无显著的变化[39]。温度和水分胁迫也会共同作用影响缩合单宁的含量，如：湿地百脉根中缩合单宁含量在夏季和秋季升高，可能是因为温度升高以及水分胁迫造成植物生长速率下降，造成CT浓度大幅度上升，但是百脉根却没有受到太大的影响[40]。品种选育和刈割管理也可调节百脉根品种的CT水平。此外，通过分子技术将丹宁合成的关键酶基因DFR(dihydroflavone reductase)转入百脉根中，发现单宁的含量显著增加，而将反义双氢黄酮醇还原酶引入百脉根中，反而导致根、茎、叶中CT含量降低，但对生物量完全没有影响[41]。

2.2.1 缩合单宁对动物疾病的影响

反刍动物容易受到由内寄生虫感染所引起的一些疾病的影响。近年来，寄生虫驱虫抗性的增加表明，有必要找到其他替代方法来控制寄生虫的生长。试验证明，含有CT的植物对反刍动物具有良好的驱虫效果：对羔羊放牧百脉根后，发现从皱胃到大肠的胃肠线虫逐渐减少，并且从百脉根中提取的缩合单宁对胃肠幼虫和鹿肺虫有抑制作用[42-43]。目前已经研究了大量涉及含有CT的百脉根对于杀虫活性的研究，但其潜在的机制仍然知之甚少，需要进一步深入研究。

表 1 百脉根中控制结瘤的主要基因Table 1 The main genes controlling nodule formation in L. corniculatus

1)转化效率低下。百脉根主要是通过农杆菌介导法进行遗传转化，外源基因整合到百脉根基因组上的成功率较低。针对不同的百脉根品种，遗传转化体系的建立仍然不够成熟，严重影响分子育种进程。

蛋白质是决定饲草价值的关键成分。当饲料进入动物的瘤胃时，蛋白质将被瘤胃中的微生物分解，导致饲料的营养价值降低。因此，植物蛋白必须在瘤胃中结合，以防止瘤胃微生物的降解并保证在皱胃中释放，以促进小肠中氨基酸的水解和吸收。CT是一种天然的黄酮类化合物，可以通过与蛋白质的氢键反应而形成稳定的复合物，称为CT-蛋白质复合物。当pH在3.5～7.0时，微生物酶活性将会降低从而影响蛋白水解细菌的生长速率；然而当pH ＜ 3.5时，CT-蛋白质复合物将解离并释放蛋白质[44]。在百脉根中添加PEG作为对照组(PEG的功能是结合和灭活缩合单宁)，将含有21.7 g·kg-1干物质(DM)缩合单宁的百脉根作为实验组分别饲养动物，发现实验组体内尿素浓度显著降低，大部分氨基酸浓度升高[45]，表明含有缩合单宁的百脉根能够有效促进动物对牧草所含蛋白质的利用，而不会影响动物的自由采食量。

缩合单宁广泛存在于双子叶植物当中，但却很少在禾本科植物当中发现。不同的双子叶植物中，缩合单宁的组织特异性定位有所不同。例如，在紫花苜蓿(Medicago sativa)中缩合单宁仅限存在于种皮中，而在白三叶(Trifolium repens)和红三叶(T. pratense)中缩合单宁仅存在于花中。

从产业学院创建目标上看，产业学院不是以盈利为目标，而是在培养行业需要的实践人才基础上充分协调校企双方诉求，达到互助互利，全面协调可持续发展。由此出发，浙江医药高等专科学校药学院与泰格医药共建产业学院职能定位为：集人才培养、技术服务及培训等功能为一体。一方面成为学校的产学研基地、“双师型”教师企业培训岗位、创新班毕业生实训基地，另一方面成立合作企业的人才培养中心，共建产业学院品牌及形象。[5]

百脉根中的CT含量对反刍动物的生产尤其是羊毛生长、产奶量、排卵率和产羔率等方面具有显著的影响。研究发现，中浓度的缩合单宁(20～45 g·kg-1)可以减少植物蛋白的瘤胃降解，增加粗蛋白质流向肠道，从而提高绵羊从饲料中获取养分的能力。然而，高浓度的CT (50 g·kg-1)会降低反刍动物的自由采食量和消化率，从而降低反刍动物体和羊毛生长的速度。对羔羊饲喂百脉根时，CT的主要作用是增加羊毛的生长速率，提高羊毛的生产率，并且发现，饲喂百脉根的羔羊胴体增重高于饲喂苜蓿的；对交配期的绵羊饲喂百脉根，CT则通过增加繁殖力和减少胚胎损失来提高绵羊的繁殖率；在母羊饲养羊羔的条件下饲喂百脉根，CT则会增加母羊的产奶量[40]。

2.3 药用特性

在百脉根的遗传变异方面也有大量研究。如：利用源于俄罗斯的15份百脉根材料，对Intersimple Sequence Repeat (ISSR)反应的5个因素进行优化并探索出适宜百脉根的ISSR反应体系[15]；利用Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)和Simple Sequence Repeats (SSR)方法分析11份意大利的百脉根的遗传变异发现，种群内变异数较高，但相比而言种群间变异数更大[16]；Abraham等[17]研究了百脉根遗传变异性与地方生境类型和物种多样性的关联性，发现百脉根遗传多样性与种群内或种群间的物种多样性并不相关，而与百脉根丰富度负相关，在其他学者的研究中也报道了类似的结果[18]；Santosr等[19]探索了美国农业部国家植物种质资源库中28份百脉根材料的遗传、形态、生态和地理距离相互之间的相关性，发现基因型的形态学相似性与采集点距离和采集点生态相似性有关，其特定的形态特征与不同的生态地理特征有关；遗传和生态之间的相似性表明具有相似生境的基因型，即使在地理上相距遥远，也能获得相似的表型。

3 百脉根的遗传改良

3.1 遗传转化体系

目前，百脉根的遗传转化体系主要通过发根农杆菌、根癌农杆菌和激光介导，而根癌农杆菌介导法是研究机理最清楚、技术方法最成熟、应用最普遍的遗传转化途径[51]，但是该方法转化效率最高仅为30%，因此对影响遗传转化的关键因素进行深入研究，有利于提高百脉根的遗传转化效率。

3.1.1 外植体

百脉根遗传转化过程中常用的外植体材料主要有子叶、真叶、茎段和下胚轴等。由于子叶和下胚轴不定芽分化频率高、再生苗生长状况良好，而真叶和茎段转化时存在再生速率低，玻璃化现象严重的缺点，因而子叶和下胚轴是目前常用的外植体材料。但实际操作过程中下胚轴容易损伤，而子叶无需通过愈伤组织形成阶段或仅有少量愈伤组织形成，降低了遗传转化过程中突变的发生几率并缩短了子叶到再生芽的发育时间，显著提高了遗传转化效率，因而子叶被认为是百脉根转化的最佳外植体材料[52]。张依然[53]的研究也报道了类似的结果，并认为带柄子叶具有相较于不带柄子叶再生率更高。

广巧将抗禽传染性法式囊病毒活性的鸡α干扰素ChIFN-α基因转入百脉根中并使得外源基因在百脉根中正确翻译和转录表达，对转基因百脉根进行生理生化研究发现转基因百脉根根系发达，生长加快、始花期提前，盛花期延长，并显著地提高了百脉根的低温耐受性[87]。王炜等[88]通过根癌农杆菌转化法，将口蹄疫病毒结构基因vp1[89]和P12A-3C 分别转入百脉根并进行筛选，检测结果表明，目的基因已经成功的整合到百脉根基因组中，具有转录活性，且目的蛋白表达正确，并对阳性植株进行扩繁，这说明利用百脉根作为生物反应器表达FMDW抗原蛋白的方法是完全可行的。郭倩倩等[78]首次使用农杆菌介导法使编码H5N1亚型禽流感病毒血凝素(AIVHA)基因转入百脉根品种“里奥”中成功的表达。唐广立等[90]将兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60基因转入到百脉根并进行成功表达；贺红霞等[91]将乙肝表面抗HBsAg基因转入百脉根基因组并表达；杨宗岐等[92]构建出猪瘟病毒主要抗原E2基因，然后在百脉根叶绿体中进行转化，实现动物疫苗的可食用性摄入。

农杆菌浓度和侵染时间的选择对转化效率也有影响。较高的农杆菌浓度(OD600nm＞ 0.8)或侵染时间将会导致附着在外植体表面或进入外植体组织中的工程菌数量增多，造成农杆菌大量扩繁，抑制外植体细胞的分裂；较低的农杆菌浓度(OD600 nm＜0.3)或侵染时间导致仅有少量的工程菌进入外植体组织中，降低了外植体获得外源基因的几率。研究发现，工程菌液(LB4404)OD600nm= 0.5时，对外植体子叶节侵染30 min左右时能获得最高的外植体诱导率[61]。贾永红等[52]使用农杆菌(EHA105)侵染子叶发现工程菌液OD600nm为0.5 ± 0.05，侵染30 min转化效果最显著。因而针对不同的农杆菌，转化所需要的农杆菌浓度及侵染时间还需要进一步明确。

3.1.2 农杆菌

植物对不同农杆菌侵染的敏感性不同，造成了转化效率之间的差异。百脉根遗传转化过程所使用的根癌农杆菌主要包括AGLO、LBA4404[55]、AGL1[56]、EHA101[57]、EHA105和GV3101[58]等。将EHA105菌株作为宿主菌转化百脉根时，具有比LBA4404和GV3101菌株更高的再生芽分化率和成苗后转化率；将根癌农杆菌AGL1、EHA105和LBA4404分别转化到百脉根发现，相较于EHA105和LBA4404菌株，AGL1菌株对百脉根再生芽的分化率为20%，是LBA4404和EHA105菌株的1.71和2.40倍，表明AGL1菌株更适宜于转化百脉根[59-60]。

不同生长时期的外植体对百脉根遗传转化也有很大影响。由于5 d之前大部分无菌苗种皮尚未脱落，子叶较小尚未完全展开，实验操作不易；而5 d之后子叶的转化率反而随着苗龄的增长而降低，苗龄达到8 d时已经无法获得转化植株[54]，因此，以5 d苗龄的子叶为佳。

3.1.3 预培养和共培养

对外植体进行预培养将有益于百脉根转化效率的提高。预培养时间过短达不到预期效果，时间过长则不利于农杆菌转化，甚至会造成外植体死亡。针对不同外植体，探索最佳预培养时间是百脉根遗传转化所必需的。贾永红等[52]对外植体预培养3～4 d后，子叶增大变厚，下胚轴长大增粗，转化效率得以显著提高。张怡然[53]发现，预培养2 d对外植体子叶节的诱导率最高。Lombari等[62]将根作为外植体转化时，经过5 d的预培养期观察到根部厚度得以显著增加。

在农杆菌转化过程中，共培养阶段是外植体与农杆菌直接接触的时期，在此阶段使用适宜的方法可以提高遗传转化效率。Handberg[63]发现，在共培养培养基上平铺一层无菌滤纸并培养7 d能够显著提高农杆菌转化效率。刘建利[51]和张振霞[64]均认为对外植体共培养3 d，有益于不定芽的分化。

3.1.4 乙酰丁香酮

2.1.2 数据需求分析。以内蒙古范围内的基础地理信息底图数据和社会人口经济需从各年度进行统计，将统计结果抽取汇总到Excel表格中，并实现通过系统功能导入数据库。

植物细胞在受伤情况下自身会分泌酚类物质，该类物质能够诱导农杆菌Vir区基因活化，吸引农杆菌向受伤的植物组织迁移[65]。因而在遗传转化过程中添加此类物质能够显著提高转化率。乙酰丁香酮(AS)是诱导效果最显著的酚类化合物[66]。孙艳香等探讨了AS对百脉根转化率的影响，发现在共培养培养基中加入20 mg·L-1的AS效果最佳；当AS浓度超过40 mg·L-1时，转化效率逐渐降低，外植体有褐化趋势；当浓度达到100 mg·L-1时，外植体全部死亡。可能是由于多酚氧化酶催化AS形成褐色的醌类物质，醌类物质在酪氨酸酶等作用下，与外植体组织中的蛋白质聚合，引起其他酶系统失活，导致组织代谢活动紊乱，生长停滞，最终衰老死亡[54]。

3.1.5 负压处理

在农杆菌侵染外植体过程中进行负压处理也会提高转化效率，主要是由于负压处理致使外植体表面形成众多细小的伤口，导致伤口处酚类物质的产生，吸引农杆菌向受伤的植物组织迁移，从而提高了转化的可能性。然而过高的负压会对外植体和农杆菌细胞造成较大的伤害，不利于芽的再生[67-68]。因而针对不同的植物材料，选用不同程度的负压进行处理。孙艳香等[54]将5 d苗龄的百脉根子叶置于-0.05 MPa压力下进行处理，发现无任何处理下的转化率为13.8%；而在5 min负压处理下百脉根的转化率可达19.0%，说明0.05 MPa负压处理5 min能够显著提高EHA105介导的百脉根遗传转化率。此外，基本培养基的选择以及激素类型等因素对百脉根的遗传转化效率也有影响，且在程星等[69]的文章中描述较多，因此本文不作探讨。

3.2 抗逆性的遗传改良

对抗逆性的研究已经成为现今生物技术研究的热门领域之一，利用转基因技术可以将外源抗逆基因导入植物之中，提高植物的抗逆性能。陈燕等[59]利用根癌农杆菌介导法首次将mtlD基因(1-磷酸甘露醇脱氢酶)转入百脉根中，并使其成功表达；侯敬尧[70]成功地构建了含有目的基因TPS1(海藻糖-6-磷酸合成酶基因)的可剔除选择性筛选标记的载体，并将其转入百脉根中使其成功表达，发现转TPS1基因百脉根的抗旱能力得到了显著的提高。拟南芥液泡膜H+-焦盐酸酶编码基因AVP1在百脉根中超表达，增强了转基因百脉根植株的耐盐性和抗旱性[69,71]。大豆液泡膜Na+/H+反向转运蛋白编码基因GmNHX1在百脉根当中过表达，提高了转基因百脉根的耐盐性[72]。AP2 / ERF家族在多重胁迫反应中起关键作用，百脉根中AP2 / ERF家族基因的全基因组进行分析显示LcAP2 / ERF107、ERF054和ERF080均可提高百脉根的耐盐性[73-74]。转录因子PeDREB2a和KcERF的共表达改善了转基因百脉根的耐旱性和耐盐性[75]。此外，笔者还整理了已经在百脉根中成功表达的外源基因(表2)。

铝(Al)毒性已被认为是酸性土壤植物生产力的一个重要限制因素，大部分Al都是无害的氧化物或硅铝酸盐，当自然过程或人类活动致使土壤变为酸性土壤时，Al会转变为有毒的三价阳离子Al3+[82]。Navascués等利用水培法使用不同的Al浓度处理百脉根发现，10 μmol·L-1铝浓度足以抑制百脉根根和芽的生长，并影响根细胞某些代谢物产生和蛋白质的含量，但不会造成活性氧的积累或氧化应激反应；增加铝浓度至20 μmol·L-1会引起活性氧积累和氧化应激反应，并且能够加强有机酸和碳水化合物代谢作用以及氧化还原调节作用[76]。

百脉根是全球范围内比较受欢迎的商业型牧草之一，但由于百脉根大田种植过程中出现大量的杂草严重影响了商业化种子的生产，因此限制与幼苗竞争水分、养分和光照的杂草对于迅速建立和保持高质量的百脉根来说显得尤为重要，而对抗除草剂百脉根的开发可能有利于解决杂草管理问题[77]。草胺膦除草剂(PPT)对环境施用安全，易被土壤微生物代谢成天然成分并且不会引起土壤污染和植物体内毒素积累而被广泛使用。PPT通过对谷氨酰胺合成酶GS的抑制而引起氨迅速积累到植物毒性水平，植物光合作用受损，随后导致植物细胞和组织死亡[80]。抗PPT的基因是从吸水链霉菌的双丙氨膦生物合成基因簇中分离的能够编码膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)的双丙氨膦抗性基因(Bar)，它能够通过乙酰化将PPT解毒从而防止PPT毒性的产生[81]。刘艳芝等[85]通过农杆菌介导将Bar基因引入百脉根，使得转基因百脉根对草胺膦除草剂拥有良好的抗性并且Bar基因能够在子代中稳定表达。磺酰脲类除草剂具有施用率低、土壤半衰期短和低毒的优点，因此使用较为广泛，而其中最著名的便是氯磺隆(CS)，它通过与乙酰乳酸合成酶(ALS)结合并使其失活，抑制必需支链氨基酸的生物合成而发挥作用。Pofelis等[86]在愈伤组织、芽和全植物水平上相继使用磺酰脲类除草剂进行筛选，最终分离出了具有抗磺酰脲类除草剂能力的百脉根。进一步研究发现除草剂抗性性状是可遗传的，但是抗性基因型种子萌发率远低于野生型种子，造成这种现象的原因目前仍待研究。

面对国家节约减排的号召以及资源形势严峻的现实，控制系统也逐年呈现出自动化的过程。目前主要我国电气工程主要应用DCS控制系统并采取集中控制手段，是控制系统自动化的典型代表。DCS系统意为分布式控制系统，它以微处理器作为基本元件以控制功能分散、显示操作集中、兼顾分而治之和综合协调为设计原则，具有数据获取直接数字控制、人机交互以及监控和管理等功能。与以前的传统式控制系统相比，它是一种更加高级的、完善的控制与管理系统。集中控制系统是将各种信息统一放入一个处理器的综合运用的技术手段。这种处理目前还存在着一些缺陷，需要继续完善和提升。

3.3 作为生物反应器

生物反应器技术以其成本低、产量大、安全性好等优点得到了广泛的应用。豆科牧草因较高的蛋白质含量而广泛应用于植物生物反应器表达系统，通过将抗原蛋白基因转入植物基因组中进行表达来生产动物口服型疫苗。而百脉根正是用于探索作为生物反应器的优良受体，在口蹄疫病毒、禽流感病毒、兔出血症病毒、乙肝表面抗原以及猪瘟病毒等方面进行广泛的研究。

在整地之前施用含枯草芽孢杆菌、胶冻样类芽孢杆菌≥3.0亿·g-1，有机质≥40%的生物有机肥4800kg·hm-2做基肥，具体可根据施用地块本身含有肥料的情况而定。

表 2 百脉根抗逆分子生物学改良研究Table 2 Molecular biological studies to improve L. corniculatus

4 百脉根分子生物学研究存在的不足

4.1 重视程度欠缺

1939-2018年，从Web of Science检索到国内外文献共7 233条结果，从中国知网检索到738条结果，其中中文文献477条，外文文献261条。对百脉根逐年文献量进行统计分析：中国知网和Web of Science数据库收集的以“百脉根”为主题的文献量呈逐年递增趋势，这说明百脉根在国际上仍旧属于研究的热门话题；自2000年起，国内不少的科研学者才加深了百脉根的探索研究，相比国际而言，我国起步明显落后于其他国家(图1、表3)。

图 1 1948-2018年百脉根逐年文献变化量Figure 1 L. corniculatus literature trend from 1948 to 2018

表 3 百脉根文献主要国家占比量Table 3 The distribution of L. corniculatus studies by country

对Web of Science检索到的7 233条百脉根相关文献进行分类发现，我国共发表了121篇文章，占据总文献的1.67%。通过中国知网检索豆科牧草-苜蓿的文献量，共检索到了31 906条结果。分析认为，百脉根作为饲草质量较高的植物，应该受到国内科研工作者进一步的重视。此外通过中国知网对百脉根的研究领域进行了计量统计。发现在对百脉根的研究当中，分子生物学和基因工程方面的研究占据比例较重，但是对如何加大百脉根资源利用和应用分子生物学技术提高产量方面的研究却少之又少，笔者认为百脉根作为一种优良的豆科牧草，应该加大对百脉根的畜牧养殖、园林绿化和草地改良等方面的研究，为百脉根的大田应用提供充足的理论依据。

4.2 生物技术领域的研究亟待加强

目前，百脉根在育种方面主要分为传统育种和分子育种。利用传统育种手段对百脉根进行育种会发现育种周期长、杂交操作困难、坐果率低、自交衰退等现象，此外传统育种手段往往依赖于实验人员的经验，具有很大的盲目性和不可预测性。近年来随着分子生物学的迅速发展，利用分子育种技术对百脉根进行优良性状的筛选，不仅仅能够显著提高育种效率还能够大大缩短育种周期，成为百脉根育种的重要手段。现如今转基因技术已经在百脉根育种方面取得了重大成果，与此同时也发现了很多不足之处。

2.2.2 缩合单宁对肠道吸收的影响

2)优良基因的筛选。目前已经发现有4类转录因子与植物的抗逆性相关，分别是bZIP类、AP2/ERF类、MYB类和WRKY类，通过在其他植物上进行筛选验证，已经发现大量抗逆功能较强的基因，但目前仅仅发现了对AP2/ERF类在百脉根进行部分转化验证，因此其他与抗逆相关的转录因子仍需不断去探索验证，以筛选出最优基因进行遗传转化。

3)遗传稳定性。单一基因构建载体进行遗传转化已经成为常规手段，将多个优良基因进行载体的构建进行转化能够大大提高百脉根的抗逆性，但在多价基因转化过程，由于百脉根的自身抵御机制和嵌合体问题，会存在基因丢失问题，从而大大影响百脉根的抗逆性，因此，针对多价共聚体转化百脉根仍需不断去探索和优化。

(3) 发动机航行速度增大时, 发动机的比冲先增大后减小. 此外, 发动机内部气相的体积分数分布情况也与航行速度有关.

目前市场启动迟缓的现状比较普遍，各大厂商为了在多雨季节里尽快销纳掉库存，避免旺季到来的时候物流过于集中，可以说是费尽了心思考虑如何才能尽快将囤货铺向市场。于是，各大厂家都不约而同地推出了“提货返还”等优惠政策。最近更是掀起了一波“先玩后买”的热潮，但事实上厂家这些营销政策的推出，并没能真正改变肥市的疲软常态。究其原因，主要还是受天气影响，农作物受灾情况较为严重。据记者调查了解，近两个月内，湖南、山东、江苏、安徽等多个省份农作物都受到了台风不同程度的破坏。

筛选标记基因的安全性。筛选标记基因虽然大幅度提高了百脉根筛选过程的简便性，同时也会带来一定的隐患：1)是否会影响外源基因的成功表达；2)限制了多个基因的同时转化；3)筛选标记是否会影响转基因百脉根的农艺性状。因而构建无删选标记基因的载体显得尤为重要。

除此之外，百脉根根瘤信号共生转导途径中各个基因的生化功能和相互关系，缩合单宁如何在蛋白质降解过程中发挥功能等研究都处于初步阶段。随着生物信息学水平的不断提高，分子生物学技术的不断发展以及百脉根全基因组测序的完成，应该会有更多全新的有意义的科研成果不断诞生。

测控专业补充标准:测控专业的专业标准侧重于评估是否真正意义上做到培养学生的专业素质素养的要求。上海理工大学自建校来,一直秉持着以教育为主,科研为辅,科研成果是为教育教学服务的办学理念。学校有长期对口合作的企业,长期派遣教师到企业挂职锻炼,并定期安排学生前往企业实习,聘请商界人士来学校进行讲座或授课以及经验交流,有意识地缩小理论课程与实际企业需求间的差距,致力于培养符合社会发展需求的优秀工程型人才。

4.3 全基因组信息有待完善

2008年日本公布了基于二代测序技术的日本百脉根(L. japonicus)基因组序列，但其组装质量较差：基因组覆盖度为67%，定位到染色体的比例仅为28%，因此序列不完整、片段化，缺少复杂的重复区域，且基因注释不完全等，这些存在的问题严重限制了对百脉根的基础研究和应用研究。拟南芥(Arabidopsis thaliana)的许多同源基因在百脉根基因组中是不完整或找不到的。例如在百脉根中发现了很多不完整片段的PIN蛋白家族成员，因不知这些片段真伪，因此无法确定PIN蛋白家族成员的数量和序列；从百脉根中分离出70多个NFP家族成员，其中30多个成员没有完整的蛋白序列；比较基因组分析蝶形亚科的全基因组复制事件(WGD)，共有1 160个WGD事件，而在百脉根中仅分析出395个WGD事件；此外，百脉根的着丝粒结构遗留不清楚，存在大量的gap。由此可见，采用三代或四代测序技术提供高质量的百脉根基因组图谱已势在必行。

5 百脉根分子生物学研究展望

1) 对百脉根特异性指纹图谱和种质资源圃的建立不仅能够保存百脉根种质的资源多样性，创建百脉根品种DNA指纹数据库，还能够为百脉根种质资源管理，优良品种选育以及生物学研究提供优越的科学依据。

2) 构建多价、无删选标记基因的表达载体，促使基因的同时表达，可加强基因表达产物在功能上的协同性。此外，通过对高蛋白基因、固氮基因、抗病虫基因、耐旱耐盐抗逆性等基因的研究探索，筛选优良基因进行百脉根的遗传转化，可以培育出更加优质、高产的牧草百脉根新品系。

3) 随着生物学技术的不断深入，探索提高农杆菌转化效率的方法已经可以得到实现，目前已有科研人员解析了半胱氨酸提高农杆菌介导的玉米(Zea mays)幼胚转化效率的机理。因而，建立快速、高效的百脉根遗传转化体系条件已经完全成熟。

4) 基于三代测序的SMRT技术开发不断加深，基于其低廉的成本、快速的数据读取速度和较高的应用潜能，必能在百脉根在基因挖掘、功能分析以及分子标记育种等方面提供更加精准的技术支持。

总而言之，针对我国饲草作物研究基础相对薄弱，草业研究局限在传统育种、生理研究等领域的研究背景，围绕国家“粮改饲”、大力发展草牧业等政策方针，通过现代生物技术对百脉根进行分子和细胞水平上的设计和操作，加速物种内基因资源的优化，打破物种之间遗传物质转移交换的天然屏障，从而定向地改进饲草作物的产量、质量和抗逆性，提高草资源的利用效率，必将会极大地促进草地畜牧业发展，促进我国的绿化和生态建设。