益肾降糖胶囊水提液澄清工艺的优选

2019-12-11黄燕潘旭东林雄单丽

安徽医药 2019年12期

黄燕，潘旭东，林雄，单丽

益肾降糖饮是福建中医药大学附属人民医院的院内制剂（批准文号闽药制字Z061060503），由制何首乌、赤芍、黄芩、玄参、地黄、黄芪等14味中药组成，具有滋阴养血、益肾通络之功效，用于糖尿病之肾虚气弱、阴血亏损、脉络瘀阻证。本品临床使用二十几年，经临床验证本方对于糖尿病肾病之蛋白尿，延缓糖尿病肾病的进展有较好的疗效［1］。因益肾降糖饮为合剂，未经任何澄清工艺，久置易产生大量沉淀，外观差，且药品体积大不易携带，液体制剂稳定性较差，容易酸败；故本试验拟将其剂型改为胶囊剂。相比其他固体制剂，胶囊剂具有掩盖药物不良气味和口味、服用方便、崩解快、溶出度高、吸收好、生物利用度高等优点，成为临床常用的剂型之一［2］。因胶囊填充剂量有限，服用量不可过大，故需对提取液进行澄清处理，尽可能去除杂质，保留适量的浸膏，要求较低的浸膏得率。处方中何首乌、赤芍为主要成分，二者的主要活性成分为二苯乙烯苷和芍药苷［3-5］，因此，本试验于2018年4—6月以二苯乙烯苷、芍药苷含量及干浸膏得率为澄清工艺优选的评价指标，比较壳聚糖澄清与醇沉的澄清效果，优选较佳的澄清工艺，为益肾降糖胶囊的工业化生产提供依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Ulit Mate-3000型高效液相色谱仪（戴安中国有限公司）；赛多利斯CPA-225D型电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；中佳SC-3614型低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）；RW20.DZM.n型悬臂式搅拌机（广州仪科实验室技术有限公司），DZF-6050型真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。

1.2 试剂芍药苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号110736—200629）；2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号110844—201512，含量以91.0%计）；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。制何首乌、赤芍、黄芩、山药等中药饮片均购自福建承创堂有限公司，经该院副主任中药师陈豪鉴定，均符合2015年版《中国药典》一部各饮片项下的规定。

2 方法与结果

2.1 芍药苷含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品适量，置25 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1毫升含芍药苷0.392 mg的对照品贮备液。精密吸取上述溶液3 mL置25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成每1毫升含芍药苷47.04 μg的溶液

2.1.2 供试品溶液的制备精密吸取益肾降糖胶囊内容物制成的澄清液2 mL，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.1.3 阴性供试品溶液的制备精密吸取缺赤芍的供试品澄清液2 mL，置25 mL容量瓶，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得阴性供试品溶液。

2.1.4 色谱条件与系统适用性试验［6-8］色谱柱：AccLaim 120 C18柱（4.6 mm×150 mm，5 m）；流动相：乙腈-水（19∶81）；流速：0.8 mL/min；检测波长：230 nm；柱温：30 ℃，进样量：10 μL。理论板数按芍药苷峰计算应不低于3 000。分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液，按上述色谱条件进样10 μL，记录色谱图，结果表明，在与对照品溶液色谱相应位置上，供试品溶液中芍药苷与其它组分分离度良好，阴性供试品溶液无干扰，见图1。

2.1.5 线性关系考察取2.1.1项下配制的对照品贮备液，分别配制成浓度为31.36、47.04、62.72、78.40、94.08 μg/mL对照品溶液，按上述色谱条件，依次进样，分别测定两次，记录芍药苷的峰面积，以芍药苷浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y̑＝0.257 1X＋1.156 0（r＝0.999 6），表明芍药苷在31.36～94.08 μg/mL范围内与峰面积成良好的线性关系。

图1 各种溶液的高效液相色谱图：A为对照品；B为供试品；C为阴性供试品

2.1.6 精密度试验精密吸取2.1.1项下的对照品溶液，重复进样6次，每次10 μL，记录芍药苷的峰面积，并计算相对标准偏差（RSD）为0.08%（n＝6），表明精密度良好。

2.1.7 重复性试验取同一批次样品，平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件测定芍药苷峰面积，RSD为1.82%（n＝6），表明该方法重复性良好。

2.1.8 稳定性试验取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12 h测定，记录芍药苷的峰面积，并计算其RSD值为1.33%（n＝6），表明供试品在12 h内基本稳定。

2.1.9 加样回收率试验精密吸取已知含量的样品溶液1 mL，平行操作6份，置25 mL容量瓶中，各精密加入已知含量的芍药苷对照品贮备液2.5 mL，并用50%甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得加样回收率试验供试品溶液，按2.1.4项下色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表1。

2.2 二苯乙烯苷含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备精密称取2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得对照品贮备溶液；精密吸取上述溶液1.0 mL置50 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成每1毫升含二苯乙烯苷17.654 μg的溶液。

表1 芍药苷加样回收率试验结果（n＝6）

2.2.2 供试品溶液的制备取2.1.2项下的供试品溶液。

2.2.3 阴性供试品溶液的制备精密吸取缺制何首乌的供试品溶液按2.1.3项下方法制备，即得阴性供试品溶液。

2.2.4 色谱条件与系统适用性试验［9-11］色谱柱：AccLaim 120 C18柱（4.6 mm×150 mm，5 m）；流动相：乙腈-水（23∶77）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：320 nm，进样量：10 μL。理论板数按2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰计算应不低于2 000。分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液，按上述色谱条件进样10 μL，记录色谱图，结果表明，在与对照品色谱相应位置上，供试品溶液中二苯乙烯苷与其它组分分离度良好，阴性供试品溶液无干扰，见图2。

2.2.5 线性关系考察取2.2.1项下配制的对照品贮备溶液，分别稀释成浓度为3.530 8、7.061 6、8.827 0、17.654 0、26.475 0、44.135 0 μg/mL的对照品溶液，按2.2.4项下色谱条件，依次进样，分别测定两次，记录二苯乙烯苷的峰面积，以二苯乙烯苷浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y̑＝0.581 5X＋0.210 8（r＝0.999 6），表明二苯乙烯苷在3.530 8～44.135 0 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.6 精密度试验精密吸取2.2.1项下的对照品溶液，重复进样6次，记录二苯乙烯苷的峰面积，并计算其RSD为0.36%（n＝6），表明精密度良好。

2.2.7 重复性试验取同一批次样品，平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件测定二苯乙烯苷的峰面积，RSD为0.98%（n＝6），表明该方法重复性良好。

2.2.8 稳定性试验取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12 h测定，记录二苯乙烯苷峰面积，并计算其RSD为1.12%（n＝6），表明供试品在12 h内基本稳定。

图2 各种溶液的高效液相色谱图：A为对照品；B为供试品；C为阴性供试品

2.2.9 加样回收率试验精密吸取已知含量的样品溶液1 mL，平行操作6份，置25 mL容量瓶中，各精密加入已知含量的二苯乙烯苷对照品溶液10 mL，并用50%甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得加样回收率试验供试品溶液，按2.2.4项下色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表2。

表2 二苯乙烯苷加样回收率试验结果（n＝6）

2.3 益肾降糖胶囊提取液的制备按100 mL处方量称取药材，加8倍量的水，煎煮两次，每次1 h，药液过滤，合并滤液备用。

2.4 浸膏得率的测定取2.3项下的滤液，按以下各澄清工艺澄清药液，取澄清液，置干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，置真空干燥箱60℃干燥至恒重，移至干燥器中，冷却30 min，迅速称重。计算干浸膏得率（%）＝干浸膏质量/药材质量×100%。

2.5 壳聚糖澄清工艺的优化

2.5.1 壳聚糖溶液的配制称取10 g壳聚糖，加1%醋酸溶液1 000 mL，搅拌，静置使其充分溶胀，搅匀，即得1%壳聚糖溶液。

2.5.2 壳聚糖澄清水提液的制备取2.3项下的滤液9份，分别将药液浓缩为药液比（药材质量：药液体积）1∶2、1∶4、1∶6的溶液各3份。

2.5.3 壳聚糖澄清工艺参数的筛选参考相关文献［12-14］，壳聚糖的澄清效果主要与药液比、壳聚糖加入量（每1克药材所需壳聚糖溶液的体积）、絮凝温度、搅拌时间、药液PH、搅拌速率、静置时间等因素有关，根据预试验结果，筛选A药液比、B壳聚糖加入量、C絮凝温度、D搅拌时间进行优化，选择L9（34）正交表设计试验，对2.5.2项下的9份提取液，按表3设计进行澄清工艺处理，将9份絮凝液室温静置24 h，离心（转速4 000 r/min，时间30 min），取上清液，将药液浓缩至100 mL，备用。以澄清液中芍药苷、二苯乙烯苷含量和浸膏得率为评价指标，采用综合加权评分法进行数据处理，三项指标权重系数分别为0.4、0.4、0.2；综合评分＝芍药苷含量/芍药苷含量最大值×100×0.4＋二苯乙烯苷含量/二苯乙烯苷含量最大值×100×0.4＋最小浸膏得率/浸膏得率×100×0.2；满分为100分，综合评分值越大，表示澄清效果越好。试验安排及结果见表4，5。

2.5.4 统计学方法本试验正交设计选用L9（34）表头，采用正交助手ⅡV3.1分析软件进行数据分析，检验水准取α＝0.05。

表3 澄清工艺正交试验因素水平表

表5 综合评分方差分析结果

2.5.5 壳聚糖澄清工艺结果分析本正交试验以芍药苷、二苯乙烯苷、浸膏得率为指标，进行综合评分。由各因素直观分析的K值高低可以得出影响絮凝效果的因素主次顺序为A＞C＞D＞B，即药液比＞絮凝温度＞搅拌时间＞壳聚糖加入量，最佳絮凝工艺组合为A1B1C3D3。以极差值最小的B因素为误差项进行方差分析，结果表明搅拌时间差异无统计学意义（P＞0.05），药液比、絮凝温度对壳聚糖絮凝纯化工艺的影响均差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）［15］。

2.5.6 壳聚糖澄清工艺验证试验按处方比例称取200 mL处方量药材，按2.3项下方法制得水提液，平行操作3份，按照最佳壳聚糖澄清工艺进行3次重复验证试验，测定芍药苷、二苯乙烯苷的含量及浸膏得率，结果分别为1.113 mg/mL、0.207 2 mg/mL、17.65%（RSD分别为0.59%、1.42%、1.82%，n＝3），说明该工艺稳定可行。

表4 正交试验设计L9（34）与结果考察

2.6 醇沉工艺乙醇沉淀法能去除药液中的淀粉、树胶等多糖类和蛋白质等杂质，影响醇沉效果的主要因素有药液浓缩比（药材质量∶药液体积）和药液含醇量，故采用单因素试验对这两个因素进行考察［16-17］。

2.6.1 药液浓缩比的考察取2.3项下的滤液3份，将药液分别浓缩至2∶1、1∶1、1∶2，加入95%乙醇，边加边搅拌，使药液含醇量为70%，药液静置24 h，离心（转速4 000 r/min，时间30 min），取上清液，将药液浓缩至100 mL。按2.1、2.2、2.4项下方法分别测定澄清液中芍药苷、二苯乙烯苷含量及浸膏得率，按2.5.3项下方法进行综合评分，结果见表6。

表6 药液浓缩比考察结果

表6结果表明：药液浓缩比为1∶2时，综合评分最高，因此选择药液浓缩比1∶2。

2.6.2 药液含醇量的考察取2.3项下的滤液7份，将药液浓缩为1∶2，分别加入95%乙醇，边加边搅拌，使含醇量分别为50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%，药液静置24 h，离心（转速4 000 r/min，时间30 min），取上清液，将药液浓缩至100 mL。按2.1、2.2、2.4项下方法分别测定澄清液中芍药苷、二苯乙烯苷含量及浸膏得率，按2.5.3项下方法进行综合评分，结果见表7。

表7 药液含醇量考察结果

表7结果表明：含醇量为70%时，综合评分最高，因此选择药液含醇量为70%。

2.6.3 醇沉工艺验证试验按处方比例称取200 mL处方量药材，按2.3项下方法制得水提液，平行操作3份，将药液浓缩为1∶2，加入95%乙醇，边加边搅拌，使含醇量为70%，药液静置24 h，离心（转速4 000 r/min，时间30 min），取上清液，将上清液浓缩至200 mL，备用。测定芍药苷、二苯乙烯苷的含量及浸膏得率，结果分别为0.980 6 mg/mL、0.207 9 mg/mL、15.24%（RSD分别为0.78%、1.28%、1.22%，n＝3），说明该工艺稳定可行。

2.7 最佳澄清工艺的确定将2.5.4与2.6.3项下两种工艺验证结果进行比较，壳聚糖澄清处理的样品芍药苷含量比醇沉工艺高13.5%，二苯乙烯苷的含量差别不大，但浸膏得率也高15.4%。壳聚糖澄清工艺不利于填充，可在后续成型工艺中优化，但在大规模生产中，若采取醇沉工艺，生产车间需要防爆设计，建造成本高，安全性能要求高。综合考虑生产成本、生产安全性，采用壳聚糖澄清工艺，具有更明显的优势，更适合医院制剂的发展，故最终确定益肾降糖胶囊水提液的澄清工艺采用壳聚糖絮凝澄清法，即药液浓缩比1∶2，在60℃絮凝温度，每1克药材壳聚糖加入量为0.4 mL，搅拌时间20 min。

根据最佳澄清工艺，100 mL澄清液可约得9 g干浸膏，初步设想浸膏∶辅料的比例为3∶1，采用95%乙醇制软材，过二号筛制粒，四号筛整粒，选择零号胶囊，每粒装0.5 g，可得24粒胶囊。后续具体工艺将在益肾降糖胶囊成型工艺研究中继续探讨。