拉曼光谱在卵巢癌诊断中的应用研究

谈芳君,金 措，唐晓琳

(甘肃省第三人民医院，甘肃 兰州 730020)

0 前言

以拉曼光谱为代表的光谱分析技术因具有无创、快捷、操作方便等特点，为生物体内大分子结构提供了“指纹”信息，近年来受到越来越多国内外学者的广泛关注[1].已有的多项研究表明，拉曼光谱技术的“指纹”特性可以反映生物体病变前后DNA、碳水化合物、蛋白质、脂类等诸多生物大分子含量及精细结构和振动结构的变化，故有望在分子水平上对疾病进行诊断[2].卵巢癌是一类常见的妇科恶性肿瘤，死亡率高居女性生殖道肿瘤的首位.由于大部分患者早期缺乏特征性临床表现，不易引起患者注意，故早期诊断有一定难度.患者发病时多已发生远处转移，治疗效果差、死亡率高，严重威胁着女性的生命健康及生活质量[4].本文利用拉曼光谱技术对卵巢癌的光谱特征进行研究，为建立一种卵巢癌临床筛查和预后监测的方法提供理论依据.

1 材料和方法

1.1 实验材料

卵巢癌SKOV3细胞株购自中国科学院上海细胞库.细胞培养所需的RPMI 1640、胎牛血清均购自美国Gibco公司.LRS-III 型拉曼光谱仪为天津市港东科技发展有限公司产品.

1.2 血清标本

选取2015年9月～2018年6月于甘肃省第三人民医院住院且签署了知情同意书的卵巢癌患者38例作为实验组，年龄在35～61岁之间，平均年龄47±9岁.38例患者均有完整的病理诊断资料，经病理活检证实为卵巢癌，且所有患者术前均未行放疗或化疗.另选取来我院行健康体检且签署知情同意的健康成人25例作为对照组，年龄在33～65岁，平均年龄45±11岁，两组资料之间的差异无统计学意义.

2 实验方法

2.1 细胞培养

SKOV3细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基中，于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中分组培养及传代.

2.2 实验仪器参数设置

光源：半导体激光器；激光源波长：532 nm；功率：40 mW；入射、出射狭缝宽度：0.10 mm；扫描步长：0.1 nm；负高压：8；积分时间：150 ms.实验均在暗室中由同一人操作完成.

2.3 样品采集及保存

所有卵巢癌患者入院后(实施手术前)取5 mL空腹外周血，常温静置4h后4 000 r/min离心10 min，取上层血清2.0 mL于EP管内，-20℃冻存备用.手术后第3天再次取5mL空腹外周血，提取2 mL血清.同样的方法提取健康对照组成人空腹外周血血清2 mL，-20℃保存待测.

SKOV3细胞融合度达到80%左右时用胰蛋白酶消化，RPMI 1640完全培养基(含10%胎牛血清)调整细胞密度为5.0×105个/mL接种至6孔板，每组6孔，置于37℃、5%CO2培养箱中分别继续培养24h、48h、72h后取细胞上清液，以正常RPMI 1640完全培养基为对照.

2.4 样品处理

将制备好的样品从-20℃冰箱取出置于室温下自然解冻，待完全溶解后用一次性注射器小心吸出并沿样品管管壁缓慢注入，注意清除气泡，随后将样品管固定于样品架上.调节开关使自然光照射到样本上，同时调整控制器移动样本台，使焦点聚集至样品管，允许激光通过并屏蔽白光.完成上述步骤后按设置的参数获得不同波数下的拉曼光谱，重复几次并记录数据.

2.5 统计学方法

所有数据均采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计量资料采用(均数±标准差)表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义.

3 结果

3.1 卵巢癌患者与健康对照组血清拉曼光谱比较

实验结果见图1，在1 034 nm、1 238 nm、1 326 nm、1 466 nm、1 671 nm 5个波长上卵巢癌患者血清均检测到重复性好的拉曼峰，健康对照组的1 238 nm处拉曼峰不明显，但与健康对照组对比，卵巢癌患者血清在5个波长处的拉曼峰值均显著增高(P<0.05)，将5个波长处拉曼峰进行Pearson相关分析，具体数值见表1.

图1 健康成人与卵巢癌患者血清拉曼光谱

3.2 卵巢癌患者术前、术后血清拉曼光谱比较

图2结果表明，将38例卵巢癌患者手术前后血清的拉曼光谱进行配对分析，发现在719 nm、 1140 nm、1238 nm和1479 nm 4个波长处手术后的拉曼峰明显低于手术前(P<0.05).将4个波长处拉曼峰进行Pearson相关分析，结果见表2.

图2 卵巢癌患者手术前后血清拉曼光谱

3.3 卵巢癌细胞培养基拉曼光谱比较

不同培养时间卵巢癌细胞培养基与正常RPMI 1640培养基的拉曼光谱结果见图3.由此可见，正常对照组仅在843 nm、1 000 nm、1 477 nm处检测到拉曼峰，而培养24 h、48 h和72 h的卵巢癌细胞培养基在735 nm、843 nm、1 000 nm、1 190 nm、1 246 nm、1 477 nm 6个拉曼频移处均可观察到重复性较好的拉曼峰，与正常RPMI 1640培养基相比差异有统计学意义(P<0.01).对24 h、 48 h和72 h卵巢癌细胞培养基的6个波长处拉曼峰进行Pearson相关分析，其相关系数分别为0.961、0.969、0.958、0.961、0.947和0.955(见表3)，表明卵巢癌细胞培养基的拉曼峰值与培养时间呈正相关(P<0.05).

4 讨论

拉曼散射是1928年由印度科学家Raman在研究液态苯和四氯化碳时发现的一种散射现象，即分子对入射光会产生大幅度的频率变化[5].随后，以拉曼效应为基础建立了拉曼光谱分析法，尤其是20世纪60年代激光器的出现，为拉曼散射提供了理想光源，从而使拉曼光谱的研究应用得到了长足发展.由于基于激光的拉曼光谱原理是物质分子的拉曼频移入射光与散射光之间的频率差，反应物质内部分子的振动和转动能级特性，故通过拉曼光谱可以从分子结构上了解物质的构成、特性及其变化规律[6].近年来，激光拉曼光谱已被广泛应用于医学领域，多项研究表明在胃癌[7]、肠癌[8]、肺癌[9]、鼻咽癌[10]、乳腺癌[11]、宫颈癌[12]、皮肤癌[13]等多种肿瘤中，癌组织与正常组织存在拉曼光谱差异.研究还发现癌组织在某些特定波长处的谱线较正常组织显著增高，形成明显的拉曼波，这种差异对于疾病的早期诊断具有重要价值，其诊断灵敏度和特异度甚至超过90%[14].

图3 不同培养时间卵巢癌细胞培养基与正常RPMI 1640培养基的拉曼光谱

通过研究发现，在1 034 nm、1 238 nm、1 326 nm、1 466 nm、1 671 nm 5个波长上卵巢癌患者血清均检测到重复性好的拉曼峰，健康对照组患者1 238 nm处拉曼峰不明显，且与健康对照组对比，卵巢癌患者血清在5个波长处的拉曼峰值均显著增高，提示拉曼光谱技术可以检测出卵巢癌患者与健康成人血清中某些代谢产物分子结构或含量的变化，体现出两者之间的差异，有潜力成为卵巢癌早期筛查的新方法.同时，对于卵巢癌术前、术后拉曼光谱改变的对比分析还发现，在719 nm、1 140 nm、1 238 nm、1 479 nm 4个波长处手术后的拉曼峰明显低于手术前，提示拉曼峰的高低可能与肿瘤本身的存在具有一定相关性，基于这个推测，拉曼光谱也许可作为监测卵巢癌疗效判断及预后的参考指标之一，即以卵巢癌患者手术前的拉曼峰作为自身基础对照，对术后的拉曼峰值进行动态观察，拉曼峰如有显著增高，即使患者无明显自觉症状也考虑可能存在隐匿病灶或复发可能性.具体临床应用价值还有待进一步研究及大宗样本的长期随访观察.除此之外，针对卵巢癌SKOV3细胞培养基拉曼波的研究表明，卵巢癌细胞培养基在735nm、843 nm、1 000 nm、1 190 nm、1 246 nm、1 477 nm 6个拉曼频移处可观察到重复性较好的拉曼峰，均高于正常RPMI 1640培养基，且拉曼峰值与培养时间呈正相关.推测是由于癌细胞本身代谢异常，导致蛋白质构象、核酸结构或含量发生改变进而引起分子振动形成叠加所致.提示拉曼光谱对卵巢癌体外研究的可能.

综上所述，拉曼光谱是一种无创、快捷、操作方便的分析技术，有望成为包括卵巢癌在内的多种肿瘤性疾病早期筛查、疗效判断、预后评估的检测手段，具有重要的临床实用价值.