MSM人群早期梅毒合并HIV感染CD8细胞的活化与凋亡

汪晓丹,赵金雪,张 明,翁文佳,高艳青*

(1首都医科大学附属北京佑安医院皮肤科,北京 100069;2北京市房山区第一医院皮肤科;*通讯作者,E-mail:gyqing2001bj@sina.com)

随着HIV/AIDS的流行及其他危险因素的增多,如静脉吸毒、男男性接触(men who have sex with men,MSM),梅毒合并HIV的感染率越来越高。梅毒以细胞免疫为主,而HIV可以破坏机体的细胞免疫。人们推测两种疾病或许有较广泛的相互作用,如早期的一些研究显示,梅毒会导致CD4+T细胞计数下降、HIV载量升高[1],进而推测,合并梅毒可能会加快HIV感染进展为AIDS。研究发现异常的CD8+T细胞免疫活化水平与AIDS进展较为密切[2]。本研究尝试从外周血CD8细胞活化与凋亡,初步探索梅毒对于HIV感染的影响。

1 材料与方法

1.1 研究对象

研究对象均来自2009-2014年首都医科大学附属北京佑安医院性病艾滋病诊疗中心随访的MSM队列人群。其中26例早期梅毒患组(包括一期、二期梅毒、早期潜伏梅毒,且不伴HIV感染),18例HIV感染组(外周血CD4+T细胞计数≥350个/μl,感染HIV时间>6个月),18例早期梅毒合并HIV感染组(外周血CD4+T细胞计数≥350个/μl,感染HIV时间>6个月)。收集病例过程中不包括年龄小于18岁、孕妇或合并有活动性肺结核的患者。所有梅毒患者均未进行驱梅治疗,所有HIV感染者均未进行高效抗逆转录病毒疗法(highly active antiretro-viral therapy,HAART)治疗。选择MSM队列中性别和年龄相匹配的未暴露于HIV和梅毒的20例健康者作为对照。一般情况见表1。

表1 四组患者的基线资料

Table 1 Baseline data of the patients

组别n年龄(岁)梅毒分期(例)基线RPR一期梅毒二期梅毒早期潜伏梅毒≤1∶41∶8-1∶32>1∶32CD4计数HIV载量 健康组2036(24-53)-------- 早期梅毒组2631(24-42)481411132-- HIV组1829(19-44)------436(359-530)30920(1294-1157417)合并组1833(20-48)35103132410(351-623)45621(460-266000)

表中的数据为中位数(范围),“-”为未检测

1.2 方法

1.2.1 Ficoll-Hypaque密度离心法分离PBMC 健康对照组采集新鲜血。取新鲜采集的EDTA抗凝全血离心(TGL-16G台式离心机,北京六一仪器厂)去除血浆后,用PBS稀释一倍,加至淋巴细胞分离液上层,2 500 r/min,离心25 min,取中间白膜层(即单核细胞和淋巴细胞富集层),PBS洗涤2遍,得到PBMC。早期梅毒组、HIV感染组、早期梅毒合并HIV感染组均为冻存PBMC,于42 ℃恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司),快速晃动冻存管,使冻存的细胞在1 min内解冻。

1.2.2 荧光抗体染色 PBMC自液氮中取出复苏后,加入荧光染色抗体表面染色:CD3 PerCP CD8a APC,CD38 PE,HLA-Dr FITC,细胞内染色:caspase-3 PE。室温孵育20 min,PBS洗涤2次后,用2%多聚甲醛重悬细胞,上机检测。

1.2.3 流式细胞仪检测 染色后的所有样品均在FACSCalibur型流式细胞仪(美国BD公司)上检测,并采用Flowjo7.6.1软件进行数据分析。以前向散射角(FSC)和侧向散射角(SSC)圈定淋巴细胞,再以CD3、CD4、CD8圈定CD8+T细胞。活化水平由CD38+HLA-DR+CD8+T细胞的比例来表示。凋亡水平由capease-3比例来表示。

1.3 数据统计分析

所有原始数据核对后采用SPSS 22.0软件(SPSS Inc,Chicago,Illinois)进行统计学分析。计量资料结果以中位数表示。组间比较采用非参数Mann-WhitneyU检验。多组间的比较采用Kruskal-Wallis秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组间CD8细胞活化的比较

采用流式细胞技术分析了HIV感染组、早期梅毒组、早期梅毒合并HIV组及健康人外周血中CD8活化标记CD38与HLA-DR的阳性率,结果表明,HIV组与合并组CD38阳性率明显高于健康组(9.44%±0.90%,9.87%±0.99%vs5.97%±0.66%,P<0.05)。早期梅毒组与其他组差异无统计学意义;HLA-DR阳性率在四组间比较,HIV组与合并组HLA-DR阳性率明显高于健康组(23.11%±1.90%,21.72%±2.15%vs4.35%±0.74%,P<0.05)。早期梅毒组与其他组差异无统计学意义(见图1)。

2.2 四组间CD8细胞凋亡的比较

采用流式细胞技术分析了HIV感染组、早期梅毒组、早期梅毒合并HIV组及健康组外周血中CD8凋亡标记caspase-3的阳性率,结果显示合并组显著高于HIV组(13.09%±2.37%vs8.21%±3.29%,P<0.05);合并组与梅毒组(1.81%±0.97%)、健康组(0.24%±0.17%)相比较,caspase-3阳性率也显著升高(P<0.001);HIV组显著高于健康组(P<0.05,见图2)。

2.3 单纯梅毒不同分期caspase-3的比较

采用流式细胞技术分析了单纯梅毒不同分期与健康人血浆caspase-3,结果显示,二期梅毒组明显高于健康组(17.91%±2.99%vs7.25%±5.65%,P<0.05,见图3)。

与健康组比较,*P<0.05

与健康组比较，*P<0.05,***P<0.001；与合并组比较，#P<0.05,###P<0.001

与健康组比较,*P<0.05

3 讨论

梅毒免疫反应极其复杂,病理生理研究表明,梅毒不仅仅是由毒性或炎症物质释放造成的简单急性炎症反应,梅毒皮损中占主导地位的是单核巨噬细胞,而非急性炎症的多核白细胞。目前认为梅毒的免疫是一种迟发型变态反应,效应T细胞产生的细胞因子在梅毒螺旋体的清除过程中起重要作用。HIV作为一种免疫缺陷病毒,可引起细胞免疫严重受损,推测HIV感染或许可以改变机体针对梅毒螺旋体的感染免疫。处于免疫缺陷状态时,梅毒可能会加速进展,甚至出现所谓的“恶性梅毒”[3-6]。本研究从外周血CD8细胞活化与凋亡方面入手,初步探索梅毒对于HIV感染的影响。

艾滋病的免疫病理改变特征主要包括:CD4细胞数量进行性减少、功能逐渐受损以及免疫系统的异常激活。CD8细胞在病毒的清除中起重要作用。CD38是一种胞外酶,与T细胞共刺激信号的传递及细胞因子的产生有关,CD38通过转导激活信号,促进T淋巴细胞的激活。HLA-DR是主要组织相容性复合物-Ⅱ类分子,主要表达在激活的T淋巴细胞上。以CD38和HLA-DR表达水平为指标的免疫激活与HIV感染进展具有很好的相关性[2,7,8]。李太生等[9]研究发现,与正常组相比,HIV组和AIDS组的T淋巴细胞各激活亚群的百分比均显著升高,CD38+CD8+亚群的百分比与CD4计数和病毒载量相关性最为密切。

有研究证实梅毒的皮损中含有丰富的CD8细胞[10]。关于活化标志HLA-DR在梅毒的研究也多数集中在局部组织。McBroom等[11]分析了6例不伴HIV的二期梅毒和5例合并HIV的二期梅毒患者,对其皮损取样,进行免疫组化分析,发现不论HIV感染状态如何,皮损组织中的炎性细胞均广泛表达HLA-DR,推测这些活化的炎性细胞通过分泌细胞因子创造局部炎性环境。章松平等[12]分析HIV患者以及HIV/AIDS合并早期隐性梅毒患者的CD3+HLA-DR+,发现单纯HIV感染,CD3+HLA-DR+比例升高,并随病程进展这种升高愈加明显,而HIV合并早期隐性梅毒患者CD3+HLA-DR+亦升高,但随病情进展,CD3+HLA-DR+没出现明显的变化,推测随着梅毒螺旋体感染的进一步发展,临床上出现了相应症状,导致CD4细胞数目显著降低,T淋巴细胞的激活程度再次加强,加速了病情的恶化。本研究发现HIV组和合并组CD38、HLA-DR的阳性率明显高于健康组,合并组与单纯HIV感染组并无差异,提示在梅毒合并HIV感染中,机体的免疫系统异常活化仍以HIV感染为主导,合并梅毒感染并未促进CD8细胞的活化。

细胞凋亡对于正常机体内环境的稳态是非常重要的,受感染细胞死亡,有利于病毒的清除[13]。Caspase是一种天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶,目前发现人源Caspase家族共有11种,根据Caspase原域长短,可将其分为起始组、炎症组和效应组[14],在HIV-1有效感染细胞内,病毒可以在T细胞中复制,完成融合,逆转录,整合,转录,翻译等全部过程,激活caspase-3,引起细胞凋亡。目前关于凋亡与梅毒螺旋体感染的研究不多,Fan等[15]研究显示,二期梅毒患者外周血淋巴细胞和CD4+T细胞凋亡比例升高,且这种凋亡与Fas途径以及Bcl-2的低表达相关。Luo等[16]体外实验发现caspase-3活性与梅毒螺旋体膜蛋白Tp92蛋白浓度相关,证实Tp92通过RIPK1/caspase-8/caspase-3通路介导THP-1细胞的凋亡。

我们研究发现单纯HIV组和合并组caspase-3高于健康人,合并组高于HIV组,推测梅毒感染在一定程度上促进了HIV感染者CD8细胞的凋亡。我们进一步分析了单纯梅毒不同分期与健康人caspase-3,结果显示二期梅毒患者明显高于健康组。由于合并组较单纯HIV感染组CD8活化指标并无显著变化,而凋亡指标显著增高。推测合并梅毒螺旋体感染可以在一定程度上加剧HIV感染者CD8细胞的凋亡,而这部分凋亡不仅仅是CD8活化诱导的细胞死亡(activation-induced cell death,AICD)所致。这与赵建斌等[17]研究结论一致。但由于本研究例数相对较少,所以我们的假设还有待更大样本量研究的进一步证实。