改性4.0代聚酰胺-胺对敏感牙本质小管矿化的封闭作用

杨常委,韩 影,贾 如,逯 宜

(1厦门医学院附属口腔医院修复科,口腔生物材料福建省高校工程研究中心,厦门 361008;2西安交通大学口腔医学院陕西省颅颌面精准医学研究重点实验室;*通讯作者,E-mail:hanying@mail.xjtu.edu.cn)

牙本质过敏症(dentin hypersensitivity,DH),主要源于磨损、酸蚀、楔状缺损、牙釉质发育不全、牙颈部无釉质或牙骨质覆盖,使牙本质小管直接开放于口腔环境中所致[1]。实际上,牙齿在正常情况下即存在着脱矿和再矿化的动态平衡过程,但在生理条件下牙齿的再矿化能力尚不足以达到治疗牙齿敏感症(DH)等齿科疾病的目的,故临床上常需要使用脱敏剂以通过封堵牙本质小管、抑制牙神经再极化等方式治疗牙齿敏感。根据生物矿化理论,有机大分子表面-OH,-COOH,-NH3可与矿物质分子钙、磷结合,促进并调控无机矿物晶体的成核、生长过程,从而促进生物基质再矿化[2]。利用这一理论,以有机大分子为模板,在脱矿牙本质表面实现再矿化过程,从而封闭牙本质小管,达到治疗牙本质过敏的目的,这也是目前口腔医学研究的热点之一。

聚酰胺-胺(PAMAM)具有高度的几何对称性、大量的官能团、分子内存在空腔及分子链增长具有可控性等特点[3],对其生物相容性的研究亦显示较低代数的PAMAM改性后在口服时未显示毒性,特别是这类高分子表面含有大量的官能团,并可以对其进行表面修饰得到具有不同用途的树状大分子(在一定条件下,聚酰胺-胺树状聚合物的末端基-NH2可以转化为另一官能团)[4,5]。改性后G4.0 PAMAM表面富含-COOH,-NH2,-OH,使牙本质脱矿后胶原中暴露的-COOH与PAMAM的-NH2端生成致密的肽健,从而接枝有机蛋白,成为控制矿化的模板,进而封闭牙本质小管[6]。本实验通过扫描电镜及显微硬度测试定性及定量分析了改性4.0代聚酰胺-胺对开放牙本质小管的封闭效果,探讨其在牙本质生物矿化过程中的作用,以期为聚酰胺-胺在牙本质敏感治疗中的应用奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂

1.1.1 样本来源 获取的标本为西安交大口腔医院牙槽外科门诊36个患者新鲜拔除的共计39个第三磨牙,项目已由医院伦理委员会授权,且患者均已签知情同意书。牙冠完整无龋坏、无裂纹,牙根完好无损,根尖周无明显异常,去离子水清洗后置于林格氏液中,4 ℃保存。

1.1.2 实验仪器 精密电子天平(AB204-S,Switzerland);集热式恒温加热磁力搅拌器(DF-101S,郑州科丰仪器设备有限公司);旋转蒸发器(RE-52A,巩义市科瑞仪器有限公司);低温烘干机(湖州欧胜电器有限公司);扫描电子显微镜(TM-10000,日本日立公司);显微维氏硬度计(2100B,美国Tukon公司)。

1.1.3 实验试剂 改性后4.0G PAMAM(本课题组自制);去离子水(日本日立公司);37%磷酸(昆山市超声仪器有限公司);人工唾液(第四军医大学口腔医院药剂科);PBS液(巩义市科瑞仪器有限公司);N,N-二甲基甲酰胺(DMF,A.R.级国药集团化学试剂有限公司);1-羟基苯并三唑(HOBT,HPLC纯度≥99%,上海吉尔生化有限公司);苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU,HPLC纯度≥99%,上海吉尔生化有限公司);N,N-二异丙基乙胺(DIPEA,纯度≥98%,上海吉尔生化有限公司)

1.2 实验方法

1.2.1 牙本质模型的建立 据Mordand等理论,制备牙本质敏感模型。去除收集离体牙上的牙石菌斑及牙周膜,置于生理盐水中超声振荡2 min,然后更换生理盐水,再重复操作一次。最后将其浸泡在生理盐水中,4 ℃冰箱保存。制作3 cm×3 cm×4 cm的硬纸制包埋盒39个,调拌稀稠度适中的超硬石膏灌入包埋盒,使离体牙牙根没入石膏内,保持牙体长轴与包埋盒长轴平行,石膏平面与釉牙骨质界根方2-3 mm处平齐,冠部及颈部暴露于外,直至石膏完全凝固。用低速切割机将离体牙从釉牙骨质界(CEJ)至牙冠方向上横向切割距CEJ 3 mm厚的柱状体,再将每个圆柱体垂直切割成4份长约3 mm×宽约3 mm×厚约1 mm的牙本质块。然后在水平研磨仪上依次用600目、700目、800目、1 000目、1 200目及1 500目的碳化硅水砂纸逐级进行打磨,抛光,使得牙本质片表面均质,光滑,平整。将已经打磨抛光好的牙本质片置于超声清洗机内,用去离子水超声清洗3次,每次10 min,以除去牙本质片表面残留的砂粒及其他杂质,低温烘干。从每个牙齿切割成的4份牙本质块中随机抽取3份进行酸蚀,用小毛刷蘸取适量的37%磷酸溶液,轻轻涂布于已预备好的牙本质片上,使牙本质片表面均匀覆盖酸蚀剂并保持10 s,使牙本质小管开放,以模拟牙本质过敏状态。然后用大量去离子水冲洗牙本质片表面3遍,用气枪轻吹干备用。在酸蚀处理前后的牙本质片中随机选取一组,共4个标本,分组编号,M1,M2,M3,M4,真空镀膜仪冠面喷金,置于扫描电子显微镜加速电压为20 kV下观察,并拍摄横断面照片(放大500倍,2 000倍,5 000倍),观察获得的牙本质片表面牙本质小管的形态、大小是否一致,以验证敏感牙本质模型的合理性,从而达到建立牙本质模型的目的。

1.2.2 样品分组及酰胺化过程 实验共3组:未改性PAMAM组、高露洁组、改性PAMAM组,每组39个牙本质块样本(每颗牙齿的牙本质模型切成4份,随机抽取3份进行酸蚀)。经过酸蚀的3份牙本质块随机分别进行三种处理。

未改性组:未改性4.0G PAMAM(聚酰胺-胺)高分子聚合物组,实验液为未改性4.0G PAMAM高分子聚合物,然后加入适量溶于无水DMF(二甲基甲酰胺)的HOBT(1-羟基苯并三唑),HBTU(苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯)和DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)肽健缩合剂(质量比,1∶1∶2)。

[16]Astika,G.G.(1993).Analytical assessment of foreign students’ writing．RELC Journal,24，6l-72.

高露洁组:以Pro-ArginTM技术(含8%精氨酸、碳酸钙和1 450 mg/L氟)开发的高露洁抗过敏牙膏组,实验液为以Pro-ArginTM技术开发的高露洁抗过敏牙膏与适量去离子水配制成的水溶液。

改性组:端基改性4.0G PAMAM高分子聚合物组,实验液为端基改性4.0G PAMAM高分子聚合物,然后加入适量溶于无水DMF的HOBT,HBTU和DIPEA肽健缩合剂(质量比,1∶1∶2)。

将各组的磨耗牙本质块分别置于各自的实验液中在25 ℃下浸泡30 min。

1.2.3 样本处理 将在实验液中浸泡过后的各组牙本质块取出后,用PBS液洗涤3次,再将洗涤过后的各组磨耗牙本质块浸泡于人工唾液中,然后置入37 ℃水浴摇床中,每48 h更换人工唾液,恒温保存2周(每周以7 d计算),此为一个周期。此操作重复4次。后将样本用PBS缓冲液分别冲洗3次,再将其置于低温烘干机内60 ℃烘干后置于0.5 ml离心管内备用。

1.2.4 扫描电子显微镜观察 于实验开始后的第2,4,6,8周分别从三组中各39个牙本质片样本中各随机抽取2个样本(每组前后抽取共8个),分组编号:A1-A8;B1-B8;C1-C8,进行扫描电镜观察,加速电压为20 kV,并拍摄横断面照片(放大倍数×500,×2 000,×5 000),观察在不同时点下观察各样本表面牙本质小管口的封闭情况,以获得牙本质表面矿化效果的定性结果,并分析时间对于敏感牙本质生物再矿化的影响。

1.2.5 显微硬度测试 8周结束后,将剩余的各31个牙本质样本进行分组编号,分别为a1-a31,b1-b31,c1-c31,分别进行显微硬度测试,以获得各组敏感牙本质表面矿物质沉积情况的定量结果,以分析不同处理对于牙本质小管再矿化效果的影响。

表面显微硬度测试是测试压头垂直压向脱矿标本的自然表面,停留一定时间,使标本产生永久性变形,由显微镜测量压痕的尺寸。使用的压头有能够提供矿物质损失与获得的间接证据,其结果与牙本质标本测试区下方的矿物含量明显相关。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 扫描电子显微镜观察

2.1.1 酸蚀前后牙本质样本的表面形貌 在5 000倍SEM下,酸蚀前可以清晰的观察到自然牙本质小管的状态,管口横断面呈灰白色,只有极个别打开,且打开不完全,大部分小管被玷污层覆盖,表面不光滑(见图1)。酸蚀后所有样本牙本质小管完全开放,形态较为均一,大小基本一致(约为4 mm),分布均匀,内无封闭物,周界清晰规整,表面光滑平整清洁(见图1)。证实磨耗牙本质模型建立完好。

图1 酸蚀前后牙本质表面形貌 (SEM,×5 000)

2.1.2 扫描电镜观察结果 于实验开始后的第2,4,6,8周分别各随机抽取2个样本进行扫描电镜观察。在5 000倍SEM下,2周后未改性PAMAM组、高露洁组及改性后PAMAM组中样本表面及管口内壁粗糙不平,有密集的颗粒状或絮状矿化物形成,牙本质小管敞开,但管径略减,三组未见明显区别(见图2)。

图2 2周后牙本质表面形貌 (SEM,×5 000)

4周后牙本质样本的表面形貌见图3。在5 000倍SEM下,未改性PAMAM组、高露洁组及改性后PAMAM组样本表面矿物质明显增多,小管管径明显变小,高露洁组和改性后PAMAM组表面较平整,管内可见有矿物沉积但小管仍开放,未改性PAMAM组管内未见有明显沉积物。

图3 4周后牙本质表面形貌 (SEM,×5 000)

6周后牙本质样本的表面形貌见图4。在5 000倍SEM下,未改性PAMAM组个别牙本质小管已完全被封闭,但沉积颗粒较大,密度较小,表面粗糙不平;高露洁组和改性后PAMAM组牙本质小管已基本被封闭,封闭物较为致密均匀,表面较为平整。

图4 6周后牙本质表面形貌 (SEM,×5 000)

8周后牙本质样本的表面形貌见图5。在5 000倍SEM下,未改性PAMAM组、高露洁组及改性后PAMAM组牙本质小管口均基本已被完全封闭,几乎没有暴露的牙本质小管,高露洁组和改性后PAMAM组晶体沉积效果更好,均匀细密。

图5 8周后牙本质表面形貌 (SEM,×5 000)

2.2 显微硬度测试结果

未改性PAMAM组、高露洁组、改性后PAMAM组牙本质块显微硬度值分别为(78.7±13.0)HV,(108.1±19.4)HV,(104.8±20.5)HV。先用Shapiro-Wilk统计学方法进行正态性检验,结果显示,三组显微硬度测试结果的P>0.05,即各组内观察值均服从正态分布。再由方差分析结果可知:显微硬度的组间差异P=0.000<0.05,差异有统计学意义,可认为3个处理组的处理效果不全相同,即3个处理组的处理效果中至少有两组是有差异的,但并不能说明各组间两两均有差异。改性后PAMAM组与未改性PAMAM组处理效果的差异有统计学意义(P=0.000),而与高露洁组处理效果的差异没有统计学意义(P=0.429);高露洁组与未改性PAMAM组处理效果的差异也有统计学意义(P=0.000)。显微硬度的组内差异均P>0.05,差异无统计学意义,可认为不同牙齿对结果的影响不在考虑范围之内。

3 讨论

1985年,自从Tomalia博士等[7]成功地合成得到聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状高分子以来,国内外学者对有关聚酰胺胺(PAMAM)树状分子的研究工作十分活跃。其分子结构精确,呈较为封闭的多孔球形三维结构,具有高度的几何对称性、大量的官能团、分子内存在空腔及分子链增长具有可控性等特点,对其生物相容性的研究亦显示较低代数的PAMAM改性后在口服时未显示毒性,特别是这类高分子表面含有大量的官能团,并可以对其进行表面修饰得到具有不同用途的树状大分子[7]。因此,在材料科学以及生物医学领域有着重要的应用前景,是目前研究最广泛、最深入的树枝状大分子之一。

口腔医学领域,牙本质过敏症(DH)是口腔临床常见病症之一。据统计,国内人群中有30%以上的人患有或曾经患有牙本质过敏症[8]。据Brannstrom流体动力理论[9],牙本质小管的开放是造成牙本质敏感的重要原因,因此,采用安全有效的生物材料封闭暴露的牙本质小管是控制牙本质敏感的重要方法。早在1935年,Grossman[10]就提出了关于牙本质过敏症的治疗要求,并一直沿用至今:对牙髓无刺激、治疗中无痛苦、容易操作、显效快、维持作用时间长且不染色。但因DH发病率较高,发病机制复杂,临床表现多样且治疗效果特别是远期效果多不理想,多年来一直困扰着口腔医生。

牙本质是由无机物和有机物组成,有机物主要为胶原,无机物主要为羟基磷灰石晶体,牙本质晶体与釉质及骨一样,具有相同的基本结构模式,即羟基磷灰石晶体(HA)。牙本质本身就是由胶原环境下的羟基磷灰石(HA)纳米颗粒组成的,因此在生物环境相似的情况下更容易得到羟基磷灰石(HA)纳米粒子。牙本质脱矿后,胶原暴露于空气中,其-COOH端裸露。根据生物矿化理论,有机大分子表面-OH,-COOH,-NH2可与矿物质分子钙、磷结合,促进并调控无机矿物晶体的成核、生长过程,从而促进生物基质再矿化。

由于树枝状聚合物(PAMAM)的组成和人体内胶原蛋白的成分非常相似,并可调整晶体的生长,所以PAMAM在牙本质生物矿化过程中为钙、磷提供了成核、沉积的模板,形成HA晶体,晶体沿纤维长轴方向生长,最后在牙本质表层会形成一有机的整体,有效解决了以往只是靠机械作用封堵牙本质小管长期效果不稳定的问题。本实验目的是通过对合成的4.0G PAMAM(表面基团全为-NH2)进行端基改性,使其表面富含-COOH,-NH2,-OH,使牙本质脱矿后胶原中暴露的-COOH与PAMAM的-NH2端生成致密的肽键,从而接枝有机蛋白,成为控制矿化的模板,进而封闭牙本质小管。本实验采用牙本质块模型,建立标准化的对照组和实验组,在实验过程中模拟口腔环境,结果通过扫描电镜(SEM)可直观、清晰地观察牙本质块表面牙本质小管的形态、大小等变化,并进行表面显微硬度测试,获得测试标本表面的矿物沉积数据,分析改性后PAMAM高分子材料对牙本质再矿化的影响。

经扫描电镜观察发现,未改性PAMAM组、高露洁组和改性后PAMAM组在不同时点下牙本质小管的矿化程度不同,均呈现出随时间变化矿化物沉积量逐渐增多,封闭面积逐渐增大,开放牙本质小管数量逐渐减小的趋势,直至8周末各组均观察到最佳的封闭效果。但经不同时点下三组牙本质矿化效果的电镜观察比较显示,高露洁组和改性后PAMAM组对开放牙本质小管均有明显的封闭效果,并明显优于未改性PAMAM组,特别是在8周末时改性后PAMAM组和高露洁组的牙本质小管口均基本完全矿化封闭,且封闭表面较平坦,均匀密实,出现山丘样隆起的的完全钙化封闭影像,而改性后PMAM未改性PAMAM组和高露洁组之间则看不出有明显区别。证明经改性后PAMAM和高露洁抗过敏牙膏处理过的牙本质块对牙本质小管均有明显的矿化效果。

本实验对同一牙齿来源并经过酸蚀过后的3个牙本质块分别采用以下3种试剂进行处理:未改性PAMAM、改性后PAMAM、高露洁抗过敏牙膏,以分析3种不同处理对牙本质小管再矿化效果的影响,排除了不同牙齿对实验的影响。并通过方差分析可知显微硬度测试结果组内差异无统计学意义(P>0.05),可认为不同牙齿对结果的影响不在考虑范围之内。所以本实验对因样本来源不同对实验的影响控制较为严格,得出的阳性结果更有说服力。

本实验对处理后的牙本质片进行显微硬度测试时,每一例牙本质片选5个位点进行压力测试,各点间距100 μm,载荷20 g,保压时间10 s,图像放大倍数×500下观察显微维氏硬度计的金刚石四棱锥形探头在样本牙本质片上压出的凹陷痕迹,利用其系统自带软件测量菱形凹陷部分的对角线长度,计算压痕面积,然后系统换算成每一例样本牙本质片的5个显微维氏硬度数值,单位为HV,最后取这5个值的平均值作为该例样本的显微维氏硬度[11]。这样可以排除同一牙本质片不同部位的差异对实验的影响。并且对每一牙本质块的显微硬度测试测量均由同一人员完成(要求此人员能熟练操作显微硬度计,但不清楚此实验的过程和目的),尽量避免了实验者主观思想对实验结果的影响,以达到更为客观、真实可靠的实验结果。

被测试样表面粗糙度直接影响显微硬度值的准确性。当被测试样表面粗糙度值Ra大于0.8 μm时,粗糙度值愈大,被测试样表面对探头的抗力愈小,塑性形变愈大,菱形压痕就愈大,得到的显微硬度值就愈小,致使其测量值偏低于真实值[12,13]。所以理论上在测量试样硬度时,必须注意被测试样表面粗糙度是否符合检测条件。在正常使用的条件下,必须保证试样的被测表面粗糙度值Ra不大于0.8 μm,若被测试样表面粗糙度值Ra大于0.8 μm,可以通过手工方法或机械方法,对被测试样表面进行打磨抛光,使其粗糙度达到检测条件。要想获得准确的测量值,必须将试样表面粗糙度的影响程度降到最低。而本实验中三种不同处理后的牙本质表面则没有进行打磨抛光以测得更为准确的显微硬度值,所以对实验结果可能会有一定的影响。后续研究中可用超声震荡等物理及化学方法处理牙本质片,不仅可减小试样表面的粗糙度,还可模拟口内行使正常口腔活动时牙本质表面沉积物会被机械去除的状态对沉积物的保留情况进行继续观察检测,进而对其脱敏效果进行综合全面评价[14,15]。

以往实验在对牙本质矿化效果的检测中,常采用单一的扫描电镜的定性检测或者是显微硬度测试的定量检测,对实验结果的分析存在一定的不准确性。本实验通过扫描电镜观察和显微硬度测试两种方法对牙本质再矿化的效果进行了定性以及定量分析,并得到了改性后PAMAM对牙本质小管具有良好的封闭作用、良好的再矿化作用，以及高露洁抗过敏牙膏无明显差异的阳性结果,实验说服力更强,可信度更高。

可以预见,随着其他交叉学科的进一步发展,树形大分子学科将逐渐融合新的科学技术,开发出这类材料的巨大的潜在应用价值,特别是近年来在口腔医学领域的研究,可谓是PAMAM的材料应用的一大突破,也越来越受到口腔界同仁的关注。当然本实验也未有验证随时间的延续,脱敏牙本质小管的远期封闭效果,后期实验可通过模拟口腔复杂环境的刺激、冲刷下的敏感牙本质模型表面牙本质小管口的封闭情况,做出有效的理论支撑,为可能的临床应用提供有力依据。