脂联素对高糖环境下视网膜血管内皮细胞自噬的影响

李 蓉,姚国敏,巨 伟,雷 凯,袁博博,张一凡,杜军辉

(1西安医学院第一附属医院眼科,西安 710077;2西安市第九医院转化医学中心;*通讯作者,E-mail:rechelrong198222@163.com)

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病主要的并发症之一,可引起严重视力损害,甚至致盲,已成为全球致盲的主要原因[1,2]。众所周知,慢性高血糖会引发炎症反应,导致血视网膜屏障破坏,激活正常静止的小胶质细胞,产生活性氧,最终导致神经元细胞死亡和视力下降。此外,视网膜表面渗漏和脆弱的血管异常增生、大量出血,最终导致玻璃体积血和视网膜脱离,成为DR患者失明的主要原因[3,4]。研究表明,在DR的发展过程中,视网膜内皮细胞功能障碍是多因素致病的重要启动因子[5]。

细胞自噬是降解细胞内成分的复杂生理过程,对于维持细胞稳态非常重要[6]。已证实,自噬功能异常在许多疾病的病理机制中发挥重要角色[7-9]。脂联素(adiponectin,APN)是一种脂细胞特异性因子,1995年首次报道[10]。近20年来,大量研究阐明了APN在肥胖、糖尿病、炎症、动脉粥样硬化和心血管疾病中的生理功能[11]。我们的前期研究发现,APN对高糖条件下的视网膜血管内皮细胞具有一定的保护作用,并能抑制血管生成过程[12,13]。近期体内体外研究均提示,APN可以调控自噬激活[14-16],但其与视网膜血管内皮细胞自噬的关系尚无报道。鉴于此,本研究观察APN对高糖培养环境下视网膜血管内皮细胞自噬水平的影响,为明确APN与自噬在DR中的关系提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

恒河猴脉络膜视网膜血管内皮细胞(RF/6A细胞)购自武汉普诺赛生命科技有限公司;1640培养基、0.25%胰酶均购自美国Gibco公司;胎牛血清购自美国Invitrogen公司;APN购自金斯瑞生生物科技有限公司。兔多抗LC3B、兔多抗Beclin-1均购自武汉三鹰生物技术有限公司;兔多抗GAPDH购自杭州贤至生物有限公司;辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司;PMSF、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、Triton X-100、DAPI、Ad-mCherry-GFP-LC3B(病毒滴度1×108pfu/ml,pfu为空斑形成单位,即单位体积的病毒形成的空斑数)均购自碧云天生物技术有限公司;PVDF膜购自美国Millipore公司;ECL底物液购自美国Thermo scientific公司;CO2恒温培养箱(日本SANYO公司,MCO-15AC型);全自动酶标仪(美国Thermo scientific公司,Multiskan MK3型);倒置显微镜(日本Olympus公司,IX51型);透射电子显微镜(日本HITACHI公司,HT7700-SS型);激光共聚焦显微镜(日本Nikon公司,C2型)。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养及分组 RF/6A细胞复苏与培养、传代方法参照既往方法[12]。取生长状态良好的细胞,按照每孔5×105个细胞均匀接种到6孔板中,37 ℃、5%CO2饱和湿度条件过夜培养。按照如下分组进行处理48 h:对照组细胞在正常培养基中培养;高糖组细胞采用含25 mmol/L D-葡萄糖的培养基培养;高糖+APN组细胞采用含25 mmol/L D-葡萄糖+15 μg/ml APN的培养基培养。

1.2.2 透射电子显微镜下观察自噬体的形成 细胞刮刮取各组细胞,用含有体积分数2.5%戊二醛的0.1 mol/L磷酸盐缓冲剂在4 ℃固定2 h;PBS充分漂洗,在质量分数1%锇酸中4 ℃固定2 h;连续梯度乙醇法细胞脱水,将细胞包埋在Embed-812媒介中48 h;在裸铜网格上用超薄切片机制备60 nm超薄切片。用质量分数2%醋酸铀饱和水溶液和枸橼酸铅各染色切片15 min;室温干燥过夜,透射电子显微镜下观察双层膜状结构的自噬体及其他相关亚细胞结构。

1.2.3 Western blot法检测自噬蛋白LC3、Beclin-1的表达 收集两组单层贴壁细胞,冰上裂解细胞,收集细胞碎片和裂解液,离心提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。取40 μg总蛋白上样,SDS-PAGE凝胶电泳,转膜,用含5%脱脂奶粉的封闭液TBST浸泡PVDF膜,室温摇床封闭2 h。封闭液稀释相应一抗(LC3B、Beclin-1及GAPDH稀释比例均为1∶1 000),使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中,4 ℃孵育过夜。TBST充分洗膜,加入稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗(1∶50 000)浸泡,37 ℃摇床孵育2 h,TBST洗涤PVDF膜后ECL显色曝光,BandScan系统扫描分析胶片灰度值,将结果与内参GAPDH的表达比较,计算相对值,重复实验3次,取平均值。

1.2.4 自噬流观察 用无菌镊子从75%酒精中取出单张细胞爬片,于酒精灯火焰上过火,烧干酒精,然后放入12孔板中;将处于对数生长期的细胞消化后,用相应培养基制备单细胞悬液,按照每孔1×105个细胞均匀地接种到12孔板中,37 ℃、5%CO2饱和湿度条件过夜培养;按照不同分组加药物处理48 h,同时每孔加入50 μl表达LC3B蛋白的荧光双标腺病毒Ad-mCherry-GFP-LC3B(转染细胞,感染复数=25),在激光共聚焦显微镜下观察自噬荧光的强弱。当早期自噬体形成时,由于LC3B位于自噬体上,GFP(绿色荧光)和mCherry(红色荧光)信号(二者融合为黄色荧光点)可被检测到。晚期自噬体与溶酶体结合形成自噬溶酶体时,绿色荧光在自噬溶酶体的酸性环境中很快淬灭,而mCherry则保持相对稳定,故此时主要能观察到红色荧光信号[17]。

2 结果

2.1 APN减少高糖环境下细胞自噬体形成

透射电子显微镜下可见三组RF/6A细胞内均有自噬体形成,典型者表现为双层膜样结构的类圆形小体,其内可见吞噬物。对照组细胞内仅见极少数自噬体形成,高糖组细胞内自噬体数量明显增多,高糖+APN组细胞内的自噬体明显少于高糖组,但多于对照组(见图1)。以上结果表明,高糖环境下RF/6A细胞自噬被诱导,APN对细胞自噬激活具有一定的抑制作用。

图1 透射电子显微镜下观察各组RF/6A细胞内自噬体形成 (×8 000,bar=500 nm)

2.2 APN减少高糖环境下细胞自噬蛋白LC3、Beclin-1的表达

Western blot实验结果显示,对照组(0.22±0.03)、高糖组(0.75±0.04)、高糖+APN组(0.54±0.05)的LC3B表达(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)比较,差异具有统计学意义(F=143.29,P<0.001)。高糖组LC3的表达明显高于对照组(P<0.001);高糖+APN组细胞LC3的表达明显低于高塘组(P<0.01),但高于对照组(P<0.001)。对照组(0.21±0.03)、高糖组(0.69±0.05)、高糖+APN组(0.39±0.03)的Beclin-1表达比较,差异具有统计学意义(F=160.36,P<0.001)。高糖组Beclin-1的表达明显高于对照组(P<0.001);高糖+APN组细胞Beclin-1的表达明显低于高塘组(P<0.001),但高于对照组(P<0.01,见图2)。上述结果表明,高糖环境可以明显诱导RF/6A细胞的自噬蛋白表达,而APN作用后对高糖诱导的自噬具有明显的抑制作用。

与对照组比较,**P<0.01,***P<0.001;与高糖组比较,##P<0.01,###P<0.001

2.3 APN抑制高糖环境下细胞内自噬流

在激光共聚焦显微镜下观察,可见对照组细胞胞质内存在弱绿色荧光点和红色荧光点(融合为黄色荧光点)。与对照组相比,高糖组细胞内的黄色和红色荧光明显增强,表明高糖环境下细胞的自噬流增强。与高糖组相比,APN组细胞内的黄色和红色荧光点均明显减少(见图3),提示APN抑制了高糖环境下的自噬流。

图3 激光共聚焦显微镜下观察各组RF/6A细胞内的自噬流 (×600,Bar=50 μm)

3 讨论

糖尿病并发症是糖尿病患者发病和死亡的主要原因。慢性高血糖是糖尿病微血管并发症(如视网膜病变、神经病变、肾病)的主要诱因。葡萄糖的处理需要利用多种多样的代谢途径,因此,慢性高血糖可引起多种细胞变化,导致并发症的发生。经典理论认为,高血糖的毒性作用及其病理生理衍生物(如氧化剂、高渗透压或糖化产物)对组织的直接作用,葡萄糖代谢产物诱导的细胞信号通路(例如磷脂或激酶的变化)的持续变化等都是高血糖致病的重要原因[18]。高血糖可诱导视网膜中出现一系列有害改变,例如微动脉瘤、出血、视网膜水肿、光感受器丢失和功能障碍等,导致糖尿病患者部分或者全部视力丧失[19-21]。鉴于高血糖和视网膜内皮细胞功能障碍在DR的重要作用,本研究模拟高血糖状态,利用RF/6A细胞在体外观察了高糖环境对视网膜血管内皮细胞自噬的影响。与既往研究一致[22],本研究也发现高糖刺激可明显促进细胞的自噬激活,表现为自噬体形成增多、自噬标记蛋白表达增加以及自噬流增强。

APN作为一种脂肪源性激素,在脂肪组织与其他器官的沟通中发挥着重要的信使作用。APN通过同源受体诱导,抑制肝脏葡萄糖的生成,增强骨骼肌的脂肪酸氧化,共同促进机体能量平衡的有益代谢作用。除了在代谢中发挥作用外,APN还通过受体依赖机制保护细胞免受凋亡和减少各种细胞类型的炎症。已有研究发现,APN主要作用于胰岛B细胞、肝细胞、心肌细胞、血管内皮细胞及免疫细胞等靶细胞,通过复杂信号通路发挥抗炎、抗氧化应激、改善内皮细胞功能及调节血管新生的作用[23,24]。目前研究提示,APN与糖尿病及心血管疾病呈负相关关系[25],但APN与DR的关系还存在争议[26,27]。例如,有研究认为血清APN与2型糖尿病患者视网膜病变的严重程度呈正相关关系[26];而另有研究发现APN与2型糖尿病患者的血清黏附分子(介导内皮细胞功能障碍)及VEGF(介导血管新生)直接相关,但不管患者是否并发DR,其血清APN水平并无差异[27]。在我们的前期体外研究中,APN可明显抑制高糖环境下的视网膜血管生成[12],但机制还不明确。心血管疾病方面的多个研究发现,APN可以调控细胞自噬,参与疾病的发病机制[14-16]。鉴于APN与视网膜血管生成、自噬三者之间存在相互联系,本研究观察了APN对高糖环境下RF/6A细胞自噬的影响,结果表明APN可明显抑制高糖诱导的细胞自噬活性,导致自噬体形成减少、自噬标记蛋白表达下降以及自噬流减弱。由于自噬对高糖环境下的视网膜血管生成具有促进作用[22],我们推测APN对该病理状况下的血管生成抑制作用可能与其抑制自噬有关。

在超微结构水平上,自噬体是一种双层膜状结构,包裹着尚未消化的细胞器,如线粒体、内质网片段或者高尔基体碎片。因此,在电子显微镜下观察到双层膜的自噬体结构是确认自噬的金标准,也是应用十分广泛的经典自噬检测方法[28]。不过,在各种囊泡结构中准确判断出真正的双层膜自噬体结构是电镜技术的核心和难点,尤其在自噬晚期,鉴别自噬溶酶体和其他内吞结构相对较为困难。一般认为不包裹或仅包裹少量内容物的囊泡结构不能被判定为自噬体[29]。然而,在实际操作的时候,没有特殊的标记是难以区分自噬体、自噬内涵体和自噬溶酶体等不同成熟阶段结构的。另外,在电镜样品制备过程中可能造成结果误差,如不同切面自噬泡个数不同,则从该切面所得结果可能与整个细胞的自噬状况相距较大,故很难进行定量分析。哺乳动物中有三种LC3(A,B,C),其中LC3B是最常用的自噬分子标记物[30]。Beclin-1是其他自噬蛋白基因参与自噬形成过程的必须成分,也常被用作自噬标记物[30]。自噬激活时,LC3-Ⅰ在泛素样反应酶的作用下与磷脂酰乙醇胺偶联生成LC3-Ⅱ。LC3-Ⅰ定位于胞质内,LC3-Ⅱ定位于自噬体膜,在电泳中LC3-Ⅱ的迁移速率大于LC3-Ⅰ,能与LC3-Ⅰ分离,故可通过Western blot法检测其表达水平,以反映自噬体的数量。不过,LC3抗体对LC3-Ⅱ有更高的亲和力,可能会造成假阳性结果[31]。自噬是一个随时间不断变化的动态过程,自噬体的形成仅是整个自噬通路过程中的一个中间结构。因此,用以上两种静态的方法去研究动态的过程得出的结论可能还存在一定的局限和偏倚,不能仅根据自噬体的增多减少或自噬标记蛋白表达的高低就得出自噬增强或减弱的结论。自噬流(autophagic flux)是一个动态连续的概念,涵盖了自噬体的形成、自噬性底物向溶酶体的运送以及在溶酶体内降解的整个过程。显然,对这整个过程进行观察较单纯自噬体检测更能反映自噬活性,因此“自噬流”分析是反映自噬活性的可靠指标,可以通过mCherry-GFP-LC3双标腺病毒进行检测。GFP在酸性环境中降解,红绿荧光融合后的黄色斑点即只是自噬体,红色斑点则指示自噬溶酶体。如自噬体和溶酶体能正常融合,则红色荧光多于黄色荧光,如自噬下游受阻,自噬体和溶酶体不能正常融合,则主要为黄色荧光[31]。

本研究采取电镜、免疫印记及自噬流检测这三种不同原理的技术对各组RF/6A细胞自噬进行了观察,形态与功能并举,可避免单一方法造成的结果误差,且注重整个自噬通路的变化。综合来看,高糖环境下细胞内自噬体增多,LC3-Ⅱ表达增多,红色和黄色荧光均增多,提示其自噬活性增强;而APN处理组细胞内自噬体减少,LC3-Ⅱ表达减少,红色和黄色荧光都减少,且主要为黄色荧光,提示APN抑制自噬活性主要是干扰了自噬体和溶酶体的正常融合过程。然而,体外实验结果不能完全代表体内的真实情形,APN对DR患者体内自噬的影响还需进一步研究。