川芎嗪对脂多糖诱导内皮细胞凋亡及Sirt1/FoxO1通路的影响
2019-12-11王太林向安萍
邹 进,王太林,向安萍*
(1岳阳职业技术学院基础医学部病理及病理生理学教研室,岳阳 414000;2岳阳市玉林生物技术有限公司;*通讯作者,E-mail:952920454@qq.com)
脓毒症是机体在重症感染、大面积烧伤、大手术等创伤后出现的危重并发症,以全身炎症反应的激活为疾病特征,可增加多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)的发生风险、死亡率较高、救治难度较大。内毒素(lipopolysaccharide,LPS)是革兰阴性菌细胞壁中的主要成分,在脓毒症的病理进程中起到关键作用,大量释放的LPS既能够刺激机体炎症反应的级联放大激活并通过炎症反应来引起内皮细胞损害,也能直接作用于血管内皮、启动细胞凋亡程序并引起内皮细胞损伤[1,2]。内皮细胞发生损害后,血管内壁结构的完整性被破坏,进而容易造成局部血栓形成、引起微循环障碍并增加MODS的发生风险[3,4]。因此,针对LPS引起的内皮细胞损伤、尤其是LPS直接引起的内皮细胞凋亡进行干预,是临床治疗脓毒症的潜在靶点[5]。
川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)是中药材川芎中的主要活性成分,临床上主要用于心脑血管疾病的治疗,也有多项细胞实验证实TMP对氧化应激、缺血缺氧引起的内皮凋亡具有抑制作用[6,7]。沉默信息调节因子1/叉头转录因子O1(silent information regulator protein/forkhead box O1,SIRT1/FoxO1)通路是内皮细胞中调节凋亡的重要通路,外界不同的病理刺激能够使Sirt1活化、去乙酰化活性增强,引起FoxO1发生去乙酰化后、去乙酰化的FoxO1从细胞核移位进入细胞浆并导致FoxO1在细胞核内抑制凋亡的作用减弱,最终造成细胞凋亡的发生[8,9]。但TMP对LPS诱导内皮细胞凋亡是否具有调节作用、以及其调节作用是否通过Sirt1/FoxO1通路来介导,目前均未明确。为此,本实验以人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)为对象,具体分析了川芎嗪对LPS诱导内皮细胞凋亡及Sirt1/FoxO1通路的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞株及主要试剂
HUVECs细胞株购自ATCC细胞公司(美国),DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶购自Gibco公司(美国),LPS购自Sigma公司(美国),TMP标准品购自北京索莱宝科技有限公司,细胞活力的MTS检测试剂盒购自Promega公司(美国),细胞凋亡的TUNEL检测试剂盒、细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司,Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3、Sirt1、FoxO1、乙酰化FoxO1的单克隆抗体购自Abcam公司(美国)。
1.2 细胞培养和处理
HUVECs用含有10% FBS的DMEM进行贴壁培养,细胞密度达到90%时,用0.25%的胰蛋白酶消化传代,每3-4 d传代1次,直至得到足够数量的细胞,接种在96孔或24孔或6孔的培养板中并进行分组处理:对照组用不含药物的DMEM处理,LPS组用含有10 μg/ml LPS的DMEM刺激24 h;TMP组参照李娇[10]的方法,选择10-10,10-12,10-14mol/L浓度的TMP对细胞进行预处理24 h,用含有10 μg/ml LPS的DMEM刺激24 h,每种处理条件重复5孔。
1.3 细胞活力检测
HUVECs接种在96孔板,不同条件处理24 h,向培养孔内加入MTS试剂盒的检测液(20 μl/孔),继续培养4 h;多功能酶标仪测定490 nm波长处的吸光值、以此作为细胞活力。
1.4 细胞凋亡检测
HUVECs接种在24孔板内,不同条件处理24 h,然后弃去培养基,4%多聚甲醛固定细胞30 min、0.3% TritonX-100孵育5 min,用TUNEL试剂盒中的检测液避光孵育细胞60 min,而后用含有DAPI的抗荧光猝灭封片液封片,在显微镜下随机观察3个视野,激发波长450-500 nm、发射波长515-565 nm、观察绿色荧光细胞数目,激发波长364 nm、发射波长454 nm、观察蓝色荧光细胞数目,计算绿色荧光细胞数目/蓝色荧光细胞数目,即为凋亡率。
1.5 Western blot检测Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3、Sirt1、FoxO1、乙酰化FoxO1的蛋白表达量
HUVECs接种在6孔板,不同条件处理24 h,然后弃去培养基,采用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒,细胞浆蛋白用于Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3、Sirt1、FoxO1的检测,细胞核蛋白用于乙酰化FoxO1。蛋白样本与上样缓冲液混合后100 ℃加热变性,变性的蛋白进行电泳、电转膜,用5%的脱脂牛奶在室温封闭NC膜2 h,用1∶1 000稀释的Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3、Sirt1、FoxO1、乙酰化FoxO1及1∶5 000稀释的β-actin第一抗体在4 ℃孵育NC膜过夜;用第二抗体在室温孵育NC膜1 h,最后曝光得到蛋白条带,以β-actin为内参、通过蛋白条带的灰度值计算Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3、Sirt1、FoxO1、乙酰化FoxO1的蛋白表达量。
1.6 统计学分析
采用SPSS23.0软件录入数据,计量资料以均数±标准差表示,多组间的比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 细胞活力及凋亡
与对照组比较,经10-10,10-11,10-12,10-13,10-14mol/L的TMP处理后,细胞活力明显增加且在该浓度范围内,随着TMP浓度的增加、细胞活力增加(P<0.05);当TMP浓度超过10-9mol/L后,10-9mol/L的TMP处理细胞后、细胞活力无明显变化(P>0.05),10-8mol/L的TMP处理细胞、细胞活力下降(P<0.05,见图1)。因而选用10-10,10-12,10-14mol/L的TMP与LPS联合处理细胞。
与对照组比较,LPS组HUVECs的细胞活力明显降低,凋亡率明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);与LPS组比较,经10-10,10-12,10-14mol/L的TMP处理后,TMP组细胞活力明显增加,凋亡率明显降低;且TMP浓度越高,细胞活力的增加及凋亡率的降低越明显,差异有统计学意义(P<0.05,见图2,3)。选用效应最显著的10-10mol/L的TMP用于后续实验。
与对照组比较,*P<0.05
2.2 细胞中Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3蛋白表达量
与对照组比较,LPS组HUVECs中Bax、Caspase-9、Caspase-3的蛋白表达量明显增加,Bcl-2的蛋白表达量明显减少(P<0.05);与LPS组比较,10-10mol/L的TMP处理后,HUVECs中Bax、Caspase-9、Caspase-3的蛋白表达量明显减少,Bcl-2的蛋白表达量明显增加(P<0.05,见图4)。
与对照组比较,*P<0.05;与LPS组比较,#P<0.05
图3 不同浓度TMP预处理后LPS对细胞凋亡的影响
2.3 细胞中Sirt1、FoxO1蛋白表达量
与对照组比较,LPS组HUVECs中Sirt1的蛋白表达量明显增多,乙酰化-FoxO1的蛋白表达量明显减少,差异有统计学意义(P<0.05),而FoxO1的蛋白表达量无明显变化(P>0.05);与LPS组比较,10-10mol/L的TMP处理后,HUVECs中Sirt1的蛋白表达量明显减少,乙酰化-FoxO1的蛋白表达量明显增多,差异有统计学意义(P<0.05),而FoxO1的蛋白表达量无明显变化(P>0.05,见图5)。
与对照组比较,*P<0.05;与LPS组比较,#P<0.05
与对照组比较,*P<0.05;与LPS组比较,#P<0.05
3 讨论
LPS引起的内皮细胞凋亡是脓毒症病理生理过程中与MODS发生密切相关的病理环节,针对性的抑制内皮细胞凋亡以保护内皮细胞成为了脓毒症治疗的潜在靶点之一。本研究以HUVECs为对象、在LPS诱导凋亡的过程中用TMP进行干预,旨在发挥TMP的内皮保护作用。TMP是中药材川芎中的活性成分,被用于多种缺血缺氧性心脑血管疾病的治疗。在脓毒症、脊髓损伤等动物模型中,TMP被证实能够抑制内皮细胞的凋亡[11,12];在缺氧、糖氧剥夺、氯化钴等病理刺激的细胞模型中,TMP同样被证实能够抑制内皮细胞的凋亡[13-15]。在上述动物实验和细胞实验的基础上,本实验将TMP用于LPS诱导内皮细胞凋亡的干预。经LPS刺激后,HUVECs的活力明显降低、凋亡率明显增加,说明LPS诱导HUVECs发生凋亡;在LPS刺激的同时加用不同浓度的TMP后,HUVECs的活力明显增加、凋亡率明显降低且TMP浓度越大,上述增强细胞活力、抑制细胞凋亡的作用越明显,说明TMP对LPS诱导的内皮细胞凋亡具有抑制作用,抗凋亡可能是TMP发挥内皮保护作用的分子机制。
高眼压大鼠模型及血管性痴呆大鼠模型中TMP的相关研究表明,TMP对Bax/Bcl-2调控的线粒体途径凋亡具有调控作用,具体表现为增加抗凋亡基因Bcl-2、抑制促凋亡基因Bax的表达。Bcl-2和Bax均定位于线粒体膜,参与线粒体膜对细胞色素C的通透性[16,17]。Bax所形成的同源二聚体是细胞色素C从线粒体进入胞质的通道、促进细胞色素C的释放,Bcl-2与Bax形成异源二聚体后能够拮抗Bax的功能、抑制细胞色素C的释放;从线粒体进入胞质的细胞色素C能够激活Caspase-9并通过下游一系列级联反应最终激活Caspase-3,进而由活化的Caspase-3来介导细胞凋亡。本实验结果表明,LPS刺激HUVECs后Bcl-2的表达明显减少,而Bax、Caspase-9、Caspase-3的表达明显增加,说明LPS能够促进内皮细胞的线粒体途径凋亡;在10-10mol/L的TMP干预后,Bcl-2的表达明显增加,而Bax、Caspase-9、Caspase-3的表达明显减少,说明TMP能够抑制LPS诱导的内皮细胞线粒体途径凋亡,与TMP在高眼压大鼠模型及血管性痴呆大鼠模型中的抗凋亡效应一致,进而更进一步表明拮抗线粒体途径凋亡是TMP发挥内皮保护作用的分子机制。
内皮细胞的线粒体凋亡途径受到多条信号通路的调控,其中Sirt1/FoxO1途径能够感受能量变化、调控Bcl-2及Bax等线粒体途径凋亡基因的表达。Sirt1具有去乙酰化的作用,在生理条件下处于受抑制状态;而当细胞受到缺血缺氧、LPS等病理因素的刺激时,Sirt1发生活化、表达增多、去乙酰化活性增强。活化的Sirt1能够使FoxO1发生去乙酰化,去乙酰化的FoxO1从细胞核进入细胞浆;离开细胞核的Foxo-1失去了抑制Bax、促进Bcl-2表达的作用,进而引起Bax表达增多、Bcl-2表达减少并造成细胞发生凋亡[18,19]。在本实验中,LPS刺激HUVECs后Sirt1的表达增多、乙酰化FoxO1的表达减少,而10-10mol/L的TMP干预后Sirt1的表达减少、乙酰化FoxO1的表达增多,说明TMP抑制线粒体途径凋亡的作用可能与抑制Sirt1/FoxO1途径有关,Sirt1受抑制能够使FoxO1的去乙酰化减弱、更多乙酰化的FoxO1留在细胞核内并发挥抗凋亡作用。
综上所述,TMP对LPS诱导内皮细胞凋亡具有抑制作用,且该作用可能与Sirt1/FoxO1通路的抑制有关,今后可进一步通过脓毒症动物模型来验证TMP对内皮功能的保护作用,进而探究TMP在脓毒症治疗中的价值。