胆脂瘤基质成纤维细胞外泌体对血管新生的影响

盛 颖,梁建民,任晓勇,李 阳

(西安交通大学第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科,西安 710004;*通讯作者,E-mail:iamdawenxi@163.com)

血管新生是指在原有血管的基础上形成新生血管,对异常增生组织的发生及生长至关重要[1,2]。胆脂瘤基质血管新生是胆脂瘤生长的先决条件[3,4]。丰富的血管供给胆脂瘤营养、氧气及去除代谢物,而减少血供则限制胆脂瘤生长。因此,明确胆脂瘤基质与周围血管的相互作用关系有助于揭示胆脂瘤异常生长机制,也为临床通过血管抑制剂治疗胆脂瘤提供理论依据。

胆脂瘤基质是由胶原纤维、纤维细胞和炎性细胞构成,在特定的微环境中调控血管的形成和功能[5,6]。人胆脂瘤基质成纤维细胞(human cholesteatoma perimatrix fibroblasts,hCPFs)通过旁分泌方式释放各种促血管生成因子刺激周围血管内皮细胞的增殖和迁移[5,6]。外泌体(exosomes)是一种重要的旁分泌介质,通过给血管内皮细胞传递信号蛋白、脂类、miRNA发挥促进或抑制血管的作用[7-10]。但hCPFs分泌的外泌体与血管再生的关系尚不清楚。本研究通过胆脂瘤基质成纤维细胞分泌的外泌体(hCPFs-Exo)对血管内皮细胞(HUVECs)迁移和生成作用的影响,探讨其与血管新生的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

本研究获得西安交通大学医学院伦理委员会批准。从5位行鼓室成形术的后天性胆脂瘤患者获得胆脂瘤和正常耳后皮肤样本各5例,均在患者签署知情同意书后获得。参照Yoshikawa等[11,12]的培养方案,PBS反复冲洗标本3次,剪碎研磨后使用0.1%胶原蛋白P(Rosch公司,瑞士)室温消化2 h,加5%胎牛血清终止消化,吹打成单细胞悬液后加入含有10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的DMEM/F12培养基(均购自Life公司,美国),放入37 ℃恒温、5% CO2细胞培养箱,每3 d半量换液,每5-7 d进行传代,第4-6代用于后续实验。

人脐静脉血管内皮细胞系(HUVECs)购买自美国ATCC公司。使用10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的DMEM/F12培养基(均购自Life公司,美国)在37 ℃恒温、5% CO2细胞培养箱孵育。

1.2 免疫组织化学染色

胆脂瘤及耳后皮肤标本用4%多聚甲醛固定并制成蜡块,以5 μm厚度切片。脱蜡后,加入鼠抗CD34(1∶100,Abcam,英国)4 ℃孵育过夜,次晨移除一抗,PBS冲洗3次,加入山羊抗鼠二抗(1∶1 000,Molecular Probes,美国)孵育1 h。PBS冲洗后苏木精复染细胞核,梯度脱水后封片、镜检。细胞质或核呈棕褐色或棕黄色反应产物代表抗原的定位。随机选取5个视野,计算视野内的微血管数量,即血管密度。

1.3 外泌体的提取及纯化

当CPF细胞的汇合度达到60%-70%时,弃去10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的DMEM/F12培养基(均购自Life公司,美国),PBS清洗贴壁细胞3遍,加入10%去外泌体胎牛血清、1%青霉素和链霉素的DMEM/F12培养基(均购自Life公司,美国)继续培养48 h。参照Oshima等[13]的方法,收集条件细胞培养上清,800g离心5 min,再以2 000g离心10 min,去除上清中的死细胞及细胞碎片。将培养基用有0.1 μm微孔滤膜过滤器,再转至装有100 000重均分子量超滤膜(Millipore,美国)的细胞搅拌超滤仪,氮气加压超滤,过滤去除剩余细胞碎片及大囊泡。再将上清在4 ℃ 100 000g超高速离心1 h,弃去上清,将外泌体重悬于PBS中。取50 μl,加入RIPA裂解液,BCA法测定外泌体浓度。

1.4 外泌体标记

纯化的Exosomes加入1 μmol/L Dil(Invitrogen,美国)染色10 min,4 ℃ 100 000g超高速离心70 min去除多余染料。PBS冲洗3次。将HUVECs接种于12孔板(1×105/孔),与Dil标记的Exosomes和共同培养6 h,4% PFA固定10 min,Hoechst 33342(Life,美国)核染5 min,PBS冲洗后在荧光显微镜(Olympus,日本)下观察和照相。

1.5 成管实验

100 μg/ml的hCPFs-Exo培养HUVECs 48 h,将HUVECs(1×105细胞/孔)接种于高糖DMEM/F12培养基(Gibico,美国),37 ℃孵育16 h。显微镜(Olympus,日本)观察管型结构。每孔随机选择3个视野计算管的长度。

1.6 细胞迁移试验

不同浓度的hCPFs-Exo(25,50,100,200,400 μg/ml)培养HUVECs 48 h,将HUVECs(1×105细胞/孔)接种于1 μm Transwell(Corning,美国)上层小室中培育48 h,使细胞通过膜小孔。透膜细胞使用4%PFA固定,结晶紫染色。每孔随机选5个视野,显微镜下计算染色细胞的数量。每个实验重复3次。

1.7 透射电子显微镜检查(TEM)

纯化的Exosomes用4% PFA及1%戊二醛固定。冲洗后将20 μl滴于载样铜网上沉淀5 min,晾干后3%水磷钨酸负染2 min,透射电子显微镜观察(Hitachi,日本)。

1.8 免疫印迹实验

免疫印迹(Western blot)采用标准实验流程,Exosomes颗粒加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液,BCA法测定蛋白浓度20 g蛋白样品上样,SDS-PAGE(Millipore,美国),凝胶电泳分离蛋白,半干法将蛋白质转移至PVDF膜上(Millipore,美国),将转好的PVDF膜于室温下在摇床上用5%脱脂牛奶TBST溶液封闭1 h,分别加入兔抗多克隆抗CD81(1∶200,Abnova,中国台湾)、兔抗多克隆抗CD63(1∶100;SBI,美国)、兔抗多克隆热休克蛋白70(HSP70)抗体(1∶100;SBI,美国)、兔抗多克隆CD9抗体(1∶100,Abcam,英国)、兔抗多克隆TSG101抗体(1∶100,Abcam,英国)和抗GAPDH抗体(1∶2 000,Santa Cruz,美国)，4 ℃孵育过夜。用TBST溶液(Sigma,美国)洗膜3次,每次10 min,加入HRP-偶合二抗(NeoBioscience,美国)室温下孵育1 h。洗膜后在增强化学发光反应混合液中反应并拍片显影。

1.9 实时定量RT-PCR分析

TRIzol法提取总RNA。定量后按照说明书使用Takara反转录试剂盒获得cDNA参照Genbank中基因序列设计引物(见表1)。以cDNA(6 μl)为模板,加入上下游引物(10 mol/L,各2 μl)和SYBR Green(10 μl)构建为PCR反应体系,在94 ℃ 50 s,55 ℃ 50 s,72 ℃ 50 s,72 ℃ 10 min,40个循环。2-ΔΔCt定量分析各基因的RNA表达情况。

表1 qRT-PCR引物序列

Table 1 Primer sequences used in qRT-PCR

基因引物序列(5′-3′) Flk1Forward: AACGACTGCCTTATGATGCC Reverse: ACTGTCCTGCAAGTTGCTGTC Fli1Forward: ACTTGGCCAAATGGACGGGACTAT Reverse: CCCGTAGTCAGGACTCCCG Angpt1Forward: CTTCAAGGCTTGGTTACTCG TC Reverse: CTCTTCCTCTCTTTTTCCTCCC Ephrin B2Forward: GTGTGGAAGTAC TGCTGGGGTGTT Reverse: GGCACAGTTGAGGAGAGGGGTATT Angpt2Forward: AAGAGATCAAGGCCTACTGTGACA Reverse: TCCTCACGTCGCTGAATAATTG HIF1AForward: ATCCATGTGACCATGAGGAAATG Reverse: TCGGCTAGTTAGGGTACACTTC Tie2Forward: TTAGCCAGCTTAGTTCTCTGTGG Reverse: AGCATCAGATACAAGAGGTAGGG

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 胆脂瘤血管分布

所有中耳胆脂瘤患者术前行MRI检查,均表现为T1WI低信号,T2WI高信号,增强MRI示胆脂瘤边缘强化(见图1)。肉眼见胆脂瘤呈现出白色卵圆形肿物,表面血管分布(见图2A)。HE染色显示胆脂瘤基质高度血管化(见图2B)。进一步CD34免疫组化染色示胆脂瘤基质血管密度和耳后皮肤存在显著性差异(P<0.05,见图3)。这些均提示血管新生是胆脂瘤基质的重要特征。

图1 中耳胆脂瘤MRI表现

图2 胆脂瘤血管的存在和分布

图3 胆脂瘤和耳后皮肤CD34染色及微血管密度比较

2.2 hCPFs-Exo的鉴定

hCPFs呈典型的梭形(见图4A)。电镜可见hCPFs-Exo为直径30-100 nm囊性微泡(见图4B)。免疫印迹结果示hCPFs-Exo表达外泌体的标志性蛋白CD81、CD63、HSP70、TSG101和CD9(见图4C)。为验证hCPFs-Exo可被HUVECs吞噬,Dil标记的hCPFs-Exo与HUVECs体外共培养6 h,细胞免疫荧光显示超过70%的HUVECs被Dil染色阳性,表明Dil标记的Exosomes已转入HUVECs(见图4D)。

2.3 hCPFs-Exo促进内皮细胞血管新生

为进一步检测hCPFs-Exo促血管新生作用,先用5种不同浓度的Exosomes(25,50,100,200,400 μg/ml)作用于HUVECs 48 h。细胞迁移实验中随hCPFs-Exo浓度的增加,HUVECs迁移细胞的数量逐渐增多(见图5A),但当hCPFs-Exo浓度超过100 μg/ml,HUVECs迁移细胞的数量趋于稳定(见图5B)。因此在后续的实验中使用100 μg/ml作为干预浓度。实时定量PCR检测hCPFs-Exo干预后HUVECs促血管新生基因Flk1、Fli1、Angpt1、Ephrin、Tie2和Angpt2的表达水平,相对于未加Exosomes的对照组明显上调(见图5C)。成管实验显示相对于未加Exosomes的对照组,hCPFs-Exo干预后,HUVECs管状结构的长度显著性增加,管网形成能力明显增强(见图5D)。

图4 hCPFs-Exo的提取及被HUVECs吞噬内移

与control组相比,*P<0.05

3 讨论

胆脂瘤是一种来自颞骨的鳞状上皮角化异常而形成的良性囊性病变,胆脂瘤局部侵袭性生长可破坏中耳及内耳结构,引起听力下降、眩晕和面瘫,甚至严重的颅内并发症。胆脂瘤的生长需要血管供养,异常的血管新生在胆脂瘤的增殖和侵袭中发挥重要作用。既往研究多通过免疫组织化学的方法证明相对于中耳黏膜和耳道皮肤,胆脂瘤基质血管丰富,VEGF、FGF-2、TGF-α和TGF-β1的表达显著增加,但这些研究多关注血管新生促胆脂瘤角化细胞和成纤维细胞的增殖和迁移，而对血管新生的发生机制研究较少[11]。本研究中胆脂瘤MRI表现为T1WI低信号，T2WI高信号，增强后瘤体边缘强化提示造影剂通过血管进入了瘤体周围基质。手术标本和组织学染色也证实胆脂瘤基质下存在丰富的血管网。在此基础上本研究进一步探索胆脂瘤基质的促血管新生的作用。

胆脂瘤基质里主要由成纤维细胞和炎性细胞构成。胆脂瘤基质成纤维细胞(hCPFs)的基因表达与耳后皮肤有明显区别[12]。例如hCPFs中LARC、GMCSF、epiregulin、ICAM1和TGFA等基因表达明显较耳后皮肤增加。hCPFs与周围细胞的相互作用在胆脂瘤炎症、内环境稳定及组织再生方面发挥重要作用[11,14,15]。例如胆脂瘤角化细胞产生的IL-1诱导hCPFs分泌角化细胞生长因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、转化生长因子,而这些hCPFs分泌的因子又刺激角化细胞增殖和分化。hCPFs通过旁分泌方式释放促血管生成因子刺激周围血管内皮细胞的增殖和迁移[5,6]。2018年Nagel等[15]首次证明hCPFs中含有干细胞,而干细胞具有很强的旁分泌和促血管新生作用。这些均提示hCPFs可以传递重要的信号物质调节血管新生。

外泌体作为一种新型的细胞间交流方式,是除可溶性蛋白质外,另一种重要的旁分泌活性物质,可通过其双层脂膜结构包裹转运蛋白质、mRNA及miRNA等活性物质进入靶细胞,参与多种生理、病理过程。与可溶性蛋白质相比,外泌体所产生的旁分泌作用更为稳定,效应方式也更为多样。多种细胞分泌的外泌体可向内皮细胞传递复杂的信息并诱导促血管或抑血管生成[7-10]。体内注射骨髓间质干细胞分泌的外泌体可以减少心肌缺血再灌注损伤,改善缺血性心脏病的血管生成[16,17]。心肌细胞母细胞生成的外泌体刺激内皮细胞的迁移[18]。由恶性胶质瘤细胞分泌的外泌体在体外可以促进内皮细胞小管形成,体内可促新生血管形成[19-21]。本研究中,首次分离并鉴定了hCPFs分泌的的外泌体,并进一步证明hCPFs-Exo可以被血管内皮细胞摄取并刺激内皮细胞的迁移和网状小管形成。这些结果说明hCPFs-Exo具有明显的促胆脂瘤血管生成作用。hCPFs-Exo具体包裹哪种活性物质,以及具体的作用机制需要进一步研究。

综上所述,本研究通过MRI、术中标本及组织学染色证明胆脂瘤基质存在异常的血管新生,提出了微环境中胆脂瘤基质成纤维细胞和内皮细胞间信息交换的假设,并进一步证实hCPFs-Exo具有明显的促内皮细胞血管新生作用。阻断二者之间的信息传递或抑制hCPFs-Exo的促血管作用,可能给胆脂瘤的非手术治疗提供新的希望。