miR-195对胃癌MKN45细胞生物学行为的影响

李玉龙,王 萍,邱 婷,常素娥,杨 阳,宗 伟*

(1陕西省人民医院消化内科,西安 710068;2西安交通大学第二附属医院骨科;3西安交通大学公共卫生学院;*通讯作者,E-mail:iamzongwei@163.com)

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,也是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一。探索胃癌发生发展过程中涉及的分子机制,寻找重要的调控分子对胃癌的治疗和预后具有重要的意义。miRNA是一类高度保守的小分子非编码的RNA,在多种肿瘤的发生发展过程中扮演重要角色。例如miR-34b抑制非小细胞肺癌细胞迁移和侵袭,并促进其凋亡[1]。miR-497-5p,miR-195-5p,miR-455-3p在黑色素瘤中低表达,过表达miR-497-5p,miR-195-5p及miR-455-3p能够抑制黑色素瘤细胞A375的增殖、迁移和侵袭[2]。miR-195是miR-15/107家族成员之一,该家族成员其5′末端附近具有相似的序列AGCAGC[3]。miR-15/107家族成员参与多种肿瘤的形成等过程。miR-195在结肠癌[4]、前列腺癌[5]、胰腺癌[6]、喉癌[7]等多种癌症中发挥抑癌基因的作用。本研究应用实时荧光定量PCR分别检测miR-195过表达质粒及miR-195抑制剂转染胃癌MKN45细胞后miR-195的表达水平。通过CCK-8实验、克隆形成实验、细胞周期实验、迁移实验检测过表达miR-195及抑制miR-195对MKN45细胞活性、周期及迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。Lipofectamine2000,Trizol购自Invitrogen公司,CCK-8试剂盒购自上海七海复泰生物科技有限公司。miR-195抑制剂序列:5′-GCCAATATTTCTGTGCTGCTA-3′，抑制剂对照序列:5′-CAGTACTTTTGTGTAGTACAA-3′，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 细胞培养

MKN45细胞(由西安交通大学汪鲁敏惠赠)用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养,置于37 ℃、5% CO2的培养箱中。

1.3 细胞转染

将MKN45细胞种于培养板中,培养箱中培养24 h,通过Lipofectamine2000将pcDNA6.2-miR-195及miR-control,miR-195抑制剂序列及抑制剂对照序列分别转染于MKN45细胞。

1.4 RNA提取及RT-PCR检测miR-195表达水平

提取转染后24 h的MKN45细胞的RNA,反转录为cDNA,实时定量PCR实验检测miR-195相对表达水平,反应程序如下:95 ℃预变性10 min;接着95 ℃变性15 s,60 ℃退火60 s,72 ℃延伸30 s,进行40个循环反应。

逆转录引物:miR-195 RT: GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGA CGCCAATA，Forward: ATCCAGTGCGTGTCGTG，Reverse: TGCTTAGCAGCACAGAAA;U6 RT: CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT，Forward: GCTTCGGCAG CACATATACTAAAAT，Reverse: CGCTTCACGAATTT GCGTGTCAT。

1.5 CCK-8实验检测miR-195对MKN45细胞活性的影响

应用Lipofectamine2000分别将pcDNA6.2-miR-195、miR-control、miR-195抑制剂序列、抑制剂对照序列转染至MKN45细胞。转染后24,48,72 h分别加入CCK-8,于37 ℃培养箱放置1 h,于450 nm波长处测定其光吸收值,OD值可间接反映活细胞数量。

1.6 克隆形成实验检测miR-195对MKN45克隆形成能力的检测

Lipofectamine2000分别将pcDNA6.2-miR-195、miR-control、miR-195抑制剂序列、抑制剂对照序列转染至MKN45细胞,转染24 h后,将细胞消化,终止,悬浮,计数。各组细胞按照1 500个/孔种在6孔板中。置于5% CO2,37 ℃培养箱中培养。每隔2 d换液。10 d后,用PBS轻轻覆盖冲洗2-3次,每孔加入0.1%的结晶紫500 μl,37 ℃,染色30 min,再用PBS冲洗干净。用凝胶成像仪拍照。

1.7 miR-195对MKN45细胞周期的影响

将MKN45细胞种于培养板中,培养24 h后将pcDNA6.2-miR-195、miR-control、miR-195抑制剂序列、抑制剂对照序列分别转染至MKN45细胞。转染48 h后,胰酶消化细胞后收集于离心管中,离心5 min。弃去上清,PBS冲洗细胞3次。弃去上清,重新加入4 ℃预冷的70%乙醇重悬细胞,4 ℃过夜固定。离心5 min,弃上清液。用PBS冲洗细胞2次,离心弃上清PBS,避光加150 μl RNA酶和150 μl PI,轻柔混合,室温避光静置30 min,流式细胞仪上机检测。

1.8 miR-195对MKN45细胞迁移的影响

MKN45细胞培养24 h,按照上述分组转染。收集转染后24 h的各组细胞,用1%胎牛血清的RPMI1640重悬细胞,细胞计数,将不同组细胞密度调整至一致。取100 μl加入上室,下室加入600 μl含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基。培养24 h,取出小室,吸去小室内的培养基,将上室内的细胞擦干净。下室加入600 μl 0.1%结晶紫,置于37 ℃染色,30 min后弃去结晶紫。用PBS多次冲洗小室,在显微镜下观察通过小室基膜的细胞并拍照。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 pcDNA6.2-miR-195及其抑制剂转染MKN45细胞后检测miR-195表达

real-time PCR检测结果显示,转染了miR-195的MKN45细胞与转染了miR-control的MKN45细胞相比较,miR-195的表达显著升高(P<0.05，见图1)。说明pcDNA6.2-miR-195转染MKN45细胞后能够高表达miR-195。转染了miR-195抑制剂的MKN45细胞与转染了抑制剂对照序列的MKN45细胞相比较,miR-195的表达明显降低(P<0.05,见图1)。

与相应对照组比较,*P<0.05

2.2 miR-195对MKN45细胞增殖的影响

CCK-8实验结果显示,转染了pcDNA6.2-miR-195的MKN45细胞的细胞活力明显低于转染了miR-control的MKN45细胞,差异有统计学意义(P<0.05,见图2)。转染了miR-195抑制剂的MKN45细胞的细胞活性与转染了抑制剂对照序列的MKN45细胞相比升高,差异有统计学意义(P<0.05,见图2)。克隆实验结果显示,转染了pcDNA6.2-miR-195的MKN45细胞的克隆数目明显少于转染了miR-control的MKN45细胞(见图2)。转染了miR-195抑制剂的MKN45细胞的克隆数目多于转染了抑制剂对照组的MKN45细胞(见图2)。

与相应对照组比较,*P<0.05

2.3 miR-195对MKN45细胞周期的影响

细胞周期实验结果显示,MKN45细胞转染了pcDNA6.2-miR-195后,S期细胞与对照组相比显著减少(P<0.05,见图3)。MKN45细胞转染了miR-195抑制剂后,与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05,见图3)。

与对照组比较,*P<0.05

2.4 miR-195对MKN45细胞迁移能力的影响

通过Transwell实验比较MKN45细胞在转染pcDNA6.2-miR-195后细胞迁移能力的改变,结果显示,转染pcDNA6.2-miR-195后,穿膜细胞数明显少于对照组(见图4)，表明miR-195能够抑制MKN45细胞的迁移能力。转染miR-195抑制剂后,穿膜细胞数明显多于对照组(见图4)，表明抑制miR-195的表达能够促进MKN45细胞的迁移能力。

图4 miR-195对胃癌MKN45细胞迁移能力的影响 (×100)

3 讨论

近年来,随着miRNAs相关研究的不断深入,已在生命科学领域取得一定的成果,尤其有关肿瘤领域,已有较多研究揭示miRNAs在多种肿瘤中存在异常表达,而miRNA的异常表达可能涉及诸多方面，如:DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传调控都能够影响miRNA的表达。miRNAs通过与靶基因mRNA3′-UTR完全或不完全的互补,抑制mRNA的翻译或降解靶mRNA,从而在细胞增殖[8]、细胞周期[9]、细胞凋亡[10]、迁移侵袭[11]、血管生成[12]等过程中发挥重要作用。

miR-195在多种肿瘤中表达下调,通过调控其靶基因,影响信号传导途径,影响各种肿瘤的致癌性。例如miR-195在结直肠癌组织中表达低于其正常对照组,其通过靶向FGF2抑制大肠癌细胞增殖[13],靶向WNT3A抑制结肠癌的增殖和转移[14]。以上研究提示miR-195在结直肠癌中发挥抑癌基因的作用;miR-195在肾透明细胞癌组织中的表达水平低于正常对照组,在肾透明细胞癌ACHN细胞中,miR-195通过靶向VEGFR2并且通过PI3K/Akt和Raf/MEK/ERK信号传导途径发挥肿瘤抑制作用[15]。miR-195通过靶向cyclin D3使肺癌细胞阻滞在G1期,通过调控survivin促进肺癌细胞凋亡[16]。miR-195-5p在鳞状细胞肺癌中表达低于对照细胞系,过表达miR-195可抑制SQCLC细胞的活力、迁移及血管生成[17]。在前列腺癌细胞中,miR-195通过调控PRR11表达抑制其增殖和血管生成[18]。Chen等[19]研究表明miR-195在肝癌患者血清中的表达水平与对照组比显著下调,在肝癌细胞系中的表达水平也显著低于对照THLE-3细胞,且过表达miR-195可抑制肝癌细胞增殖,而抑制miR-195则促进肝癌细胞增殖,提示miR-195在肝癌进展中扮演抑癌基因的角色。已有研究报道miR-195可抑制胃癌细胞的迁移及侵袭[20,21]。以上研究表明miR-195在多种肿瘤中发挥抑癌基因的作用。

通过转染miR-195至MKN45细胞促使miR-195高表达,转染miR-195抑制剂抑制miR-195表达,从而全面研究miR-195过表达及抑制对MKN45生物学活性的影响,结果表明:miR-195过表达能够抑制MKN45细胞的增殖及克隆形成,而沉默miR-195的表达可以促进其增殖及克隆形成;过表达miR-195后处于S期的细胞显著减少,但抑制miR-195的表达对MKN45细胞周期没有显著影响;迁移侵袭实验表明过表达miR-195可抑制MKN45细胞的迁移,而抑制其表达可促进MKN45细胞的迁移。以上结果提示miR-195在胃癌细胞MKN45中发挥抑癌基因的作用,因此miR-195有可能成为胃癌治疗的新靶点,为胃癌的治疗提供新思路。