靶向SALL4脱氧核酶抑制肝细胞癌恶性表型的实验研究

王 珊,王 菲,郑晓源,赵必星*

(1西安市第四医院检验科,西安 710004;2福建医科大学孟超肝胆医院;*通讯作者,E-mail:heady@126.com)

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC,简称肝癌)是全球最常见恶性肿瘤之一。尽管近几年对肝癌的治疗方法取得一定的进展,但肝癌的5年生存率依然很低,寻找新的治疗靶点和方法是目前的关键。

人类婆罗双树样基因-4(SALL4)是一种新发现的原癌基因,多项研究表明其与遗传性疾病、白血病、淋巴瘤等疾病发生发展有密切关系[1,2]。SALL基因与参与果蝇多种器官发育的Spalt基因同源,SALL4基因编码的蛋白质属于含有锌指结构的转录因子。最近在肝癌的研究中发现,部分的肝癌病例中,SALL4重新高表达[3],并且SALL4的表达与肝癌患者的不良预后密切相关。基因分析也显示在SALL4阳性的肝癌中,伴随细胞增殖与侵袭相关基因的高表达,表明SALL4与肝癌的发生发展密切相关,可能作为一个潜在的肝癌治疗的靶标。此外,在肝癌细胞中过表达SALL4促进肝癌细胞增殖和侵袭能力,同时也提高了上皮细胞黏附分子(epCAM)、角蛋白19(CK19)、CD44等肝癌干性标志分子的表达[4,5]。可见,SALL4的表达与肝癌的发生、复发、转移密切相关,抑制SALL4的表达可能是一个潜在的肝癌治疗的靶点。

脱氧核酶(DNAzyme)是通过体外筛选技术获得的有酶活性的单链DNA分子。随着越来越多的脱氧核酶被筛选出来,科学家对其功能性质的研究也逐渐深入。其中,RNA切割作用作为脱氧核酶最重要的一种特性,是目前研究热点[6,7]。目前最具应用前景的是10-23型脱氧核酶,该脱氧核酶由包含15个固定核苷酸序列的催化中心和两侧底物结合臂(7-12个核苷酸)构成。10-23型脱氧核酶能高选择性识别、裂解RNA分子中的嘌呤-嘧啶位点,进而阻断mRNA的转录和翻译。如靶向c-jun的10-23型脱氧核酶,在动物实验中表现出对皮肤癌的显著抑制效果,目前已开展临床试验[8,9]。

本研究设计靶向SALL4 mRNA的脱氧核酶,并观察其对人肝癌细胞HepG2恶性表型的影响,为应用脱氧核酶抑制肝癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

HepG2细胞购置于美国ATCC。Lipofectamine 3000转染试剂购于Invitrogen公司;RNA体外转录试剂盒AmpliScribeTMT7 High Yield Transcription Kit购于Lucigen公司,CCK-8试剂盒购于Dojundo公司,RNA反转录试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit购于罗氏公司。脱氧核酶根据Genbank中SALL4 mRNA序列,分别针对106,614,966和1 656四个位点设计10-23脱氧核酶,同时设计无活性阴性对照,由生工生物工程上海股份有限公司合成(见表1)。为提高脱氧核酶在细胞内的稳定性,对其两端的各3个碱基进行硫代磷酸化修饰。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染 HepG2细胞培养于含10%胎牛血清(Gibico,美国)的培养基中。转染前将5×105HepG2细胞接种至6孔板中培养,当细胞密度达到60%-70%时,按Lipofectamine 3000转染试剂说明书将合成的DNAzyme转染到细胞中。

表1 脱氧核酶名称和序列

Table 1 Deoxyribozyme names and sequences

脱氧核酶名称序列 靶向切割SALL4位点Dz-1GCCTCGACAGGCTAGCTACAACGAGGTGCGAGC106Dz-2TTGGCTAAAGGCTAGCTACAACGAAGCTTATGT614Dz-3TTCAAGGCAGGCTAGCTACAACGACCAGAGACA966Dz-4GTGGGTCCAGGCTAGCTACAACGACCTCACTTT1656阴性对照GCGACGTGAGGCTAGCTACAACGAAGTGCAGCG-

1.2.2 实时荧光定量PCR 为了检测靶向SALL4的DNAzyme对SALL4 mRNA表达的影响,在HepG2细胞中分别转染阴性对照DNA、Dz-1、Dz-2、Dz-3和Dz-4,实时荧光定量PCR(real-time PCR)实验在细胞转染24-48 h后收集细胞,Trizol法提取总RNA,RNA产物使用Roche transcriptor first strand cDNAsynthesis kit,按照试剂盒说明书步骤进行反转录,合成cDNA,再以cDNA为模板,加入引物进行PCR扩增反应。SALL4和内参基因引物由上海生工公司合成(见表2)。

表2 qPCR引物名称和序列

Table 2 Primer names and sequences for qPCR

引物序列 SALL4F:CGCCCCGTGTGTCATGTAGTGAACR:TCCGAGAACAGCCGCACTGAGATGGAAGGAPDHF:AGCCACATCGCTCAGACACR:GCCCAATACGACCAAATCC

1.2.3 Western blot 为了检测靶向SALL4的DNAzyme对SALL4蛋白表达的影响,同样在HepG2细胞中分别转染阴性对照DNA、Dz-1、Dz-2、Dz-3和Dz-4,48 h后采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白,进行SDS-PAGE凝胶电泳,将凝胶中的蛋白转移至NC膜,分别用抗SALL4、β-actin一抗及对应的二抗孵育,ECL显色,并在凝胶成像分析系统中进行曝光成像。

1.2.4 体外靶向切割实验 为了检测Dz-2和Dz-4体外靶向切割SALL4 mRNA的能力,先收集HepG2细胞,采用AmpliScribeTMT7 High Yield Transcription Kit并参照说明书进行基因组DNA提取和体外RNA的转录(SALL4 RNA转录引物序列:sall4-T1-F:TAATACGACTCACTATAGGGAGACGAGGGGCC-TGTGCCTTCAGA;sall4-T1-R:ACATCCACCGCGGAGATGTTC;sall4-T2-F:TAATACGACTCACTATAGGGAGATGCCGAGTTCCA GGACAAAGT;sall4-T2-R:CGAGTGGATGCTGGGAAGAG)。转录后的RNA样品中加入不同的DNAzymes(阴性对照、Dz-2和Dz-4),在金属离子Mg2+的作用下对SALL4 RNA的切割作用,反应体系:2 pmol/ml DNAzymes 3 μl,2 pmol/ml RNA产物3 μl,50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5),120 mmol/L NaCl,10 mmol/L Mg2+,37 ℃反应30 min后样品放冰上冷却,与10×RNA Loading Buffer混合,在5%琼脂糖凝胶中进行电泳分析。

1.2.5 CCK-8细胞增殖实验 为了验证Dz-2对肝癌细胞增殖的影响,HepG2细胞分别转染阴性对照DNA和Dz-2,单独的HepG2细胞为空白对照组,收集对数生长期的转染后的HepG2细胞,接种于96孔板(1×105/ml),48 h后加入10 μl CCK-8试剂,在细胞培养箱中继续培养4 h,用酶标仪测定450 nm处的吸光值,评估细胞增殖能力。

1.2.6 Transwell迁移和侵袭实验 为了检测Dz-2对肝癌细胞迁移和侵袭的影响,在HepG2细胞中分别转染阴性对照质粒和Dz-2,转染后的细胞接种在不含血清的DMEM培养基中,调整细胞密度为2×105个/ml,吸取150 μl细胞至Transwell上室,下室加入含10%胎牛血清的DMEM培养基500 μl,培养24 h,4%多聚甲醛固定细胞后,用结晶紫染色,在显微镜下拍照和细胞计数,随机选择5个视野计数,评价细胞迁移能力。细胞侵袭能力检测使用铺有Matrigel胶的Transwell小室进行上述实验。

1.2.7 细胞划痕实验 为了验证Dz-2对肝癌细胞迁移的影响,使用细胞迁移培养插件ibidi Culture-Inserts进行,参照说明书进行细胞划痕实验,首先在HepG2细胞中分别Dz-2和阴性对照DNA,转染后的细胞制备成5×105个/ml的细胞悬液,在Culture-Inserts每一小格加入细胞悬液70 μl。培养过夜,用无菌镊子夹着Culture-Inserts一角,轻轻移除;用预热PBS轻轻润洗,去除未贴壁的细胞,再加入2 ml培养基继续培养和在不同时间点拍照。

1.2.8 肿瘤成球实验 为了检测Dz-2对肝癌细胞成球能力的影响,先在HepG2细胞中分别转染Dz-2和阴性对照DNA,转染后的细胞接种于96孔低黏附培养板中,使用成球培养基调整细胞密度为4 000个/孔,培养一周后,显微镜下计数细胞球个数。(成球培养基成分:50 ml DMEM/F12培养基,20 ng/ml表皮生长因子;10 ng/ml成纤维生长因子;5 μg/ml胰岛素;0.4% FBS)。

1.3 统计学分析

统计学分析采用统计学软件GraphPad-Prism-7.0对统计数据进行分析,结果用平均数±标准差表示,多组间差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA),两组间比较采用t检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 脱氧核酶靶向抑制SALL4表达

荧光定量PCR结果显示,与阴性对照组相比,脱氧核酶Dz-2和Dz-4都能够较显著抑制SALL4 mRNA水平(P<0.01,见图1)。进一步的Western blot结果显示Dz-2显著抑制了SALL4的蛋白水平(P<0.01,见图2),体外靶向切割RNA实验也证实,Dz-2对SALL4 mRNA具有靶向切割能力(见图3)。因此后续实验主要采用Dz-2进行相关功能研究。

与阴性对照比较,*P<0.05,**P<0.01

与阴性对照比较,**P<0.01

图3 Dz-2靶向切割SALL4 RNA

2.2 脱氧核酶靶向抑制肝癌细胞增殖、侵袭、迁移和成球等恶性表型

用CCK-8细胞增殖实验检测空白对照组、阴性对照组和Dz-2组的细胞增殖能力,结果见图4。与阴性对照组相比,Dz-2显著抑制了肝癌细胞的增殖(P<0.01)。Transwell细胞侵袭和迁移实验结果显示,阴性对照组迁移细胞个数为(488.3±45.6)个/视野,而Dz-2组迁移细胞个数为(176.7±18.6)个/视野,两组比较差异有统计学意义(P<0.01，见图5);侵袭实验中,阴性对照组侵袭细胞个数为(127.3±11.4)个,而Dz-2组为(58.7±9.1)个,两组比较差异有统计学意义(P<0.01,见图5),结果表明Dz-2能够显著抑制肝癌细胞的侵袭和迁移。细胞划痕实验进一步证实,Dz-2确实在肝癌细胞中发挥抑制迁移的功能,在划痕后继续培养72 h和96 h,阴性对照组细胞迁移率为93.1%±2.5%和100%,而Dz-2组的细胞迁移率分别为67.7%±5.1%和91.1%±2.4%,与阴性对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01,见图6)。另外,肿瘤细胞成球实验显示,阴性对照组细胞成球个数为(70±8)个/视野,而Dz-2组为(30±6.08)个/视野,两组比较差异具有统计学意义(P<0.01，见图7),证实Dz-2抑制了肝癌细胞的成球能力。

与阴性对照比较，**P<0.01

与阴性对照比较，**P<0.01

图6 细胞划痕实验证实Dz-2抑制肝癌细胞迁移

图7 Dz-2抑制肝癌细胞成球能力

3 讨论

SALL4作为一个转录因子在维持胚胎干细胞自我更新和多向分化潜能方面发挥至关重要的作用。最近的研究显示SALL4高表达与肝癌的恶性表型以及不良预后密切相关[3,5,10]。作为肝癌中的干细胞生物标志物,SALL4通过靶向多种基因调节细胞增殖、凋亡、迁移/侵袭、耐药性和干性。因此,在肝癌中,抑制SALL4的表达可能是一个潜在的治疗策略。哈佛医学院Daniel G.Tenen教授针对SALL4-NuRD结合位点开发了靶向SALL4的多肽,在动物实验中显示出强大的抗肿瘤特性[11]。而在我们的研究中,针对SALL4设计了4个脱氧核酶,其中Dz-2(序列为:TTGGCTAAAGGCTAGCTACAACGAAGCTTATGT)抑制SALL4表达的同时,显著抑制了肝癌细胞的增殖、侵袭、迁移和自我更新等恶性表型,表明靶向SALL4的脱氧核酶具有潜在的抗肿瘤能力,具有潜在的临床应用价值。

具有RNA切割功能的脱氧核酶能够特异性地切割目标RNA,阻断蛋白的翻译工作,达到对蛋白质调控的目的,因此,脱氧核酶已经被成功地应用于多类临床疾病的治疗[6,7,12]。继第一个针对抑制Bcr-Abl癌基因的DNAzyme被用于急性淋巴细胞性白血病的研究后[13],DNAzyme作为一类新型生物技术来源药物,在肿瘤基因治疗领域的研究中已经凸显出巨大的意义。10-23脱氧核酶是体外筛选所获得的脱氧核酶分子,具有分子小、易于合成与修饰、稳定性高、切割RNA分子效率高于核酶、不需要细胞内其他酶参与等优点。脱氧核酶靶向切割RNA分子建立在序列识别基础上,具有很高的特异性,对除靶RNA以外的其他RNA水平几乎没有影响[6]。Zhang等[14]设计了针对血管内皮生长因子2(VEGFR2)的10-23脱氧核酶,能够显著抑制血管内皮细胞生长,并使肿瘤体积缩小近75%。Cai等[9]设计了靶向c-Jun的10-23脱氧核酶Dz13,显示出对基底细胞癌和鳞状细胞癌强大的抑制效果,并且一期临床实验显示Dz13具有良好的生物安全性和耐受效果[8]。这些研究都显示了脱氧核酶在肿瘤的基因治疗方面具有很好的应用前景。

作为一种新型的治疗药物,脱氧核酶主要存在的问题是能否找到最合适的靶基因作用位点,本研究虽然设计了4个针对SALL4的位点,但最终结果只有一个有一定的靶向切割效果。针对更多位点设计脱氧核酶,以取得更高的切割效率和进一步在动物体内探讨脱氧核酶抑制肝癌的效果,这些都需要我们进一步的深入研究。