牛结节性皮肤病ELISA检测试剂盒验证试验

薛文 苏晓慧 秦菊 努尔麦麦提·阿穆提 居马别克·夏拉巴依 王文

摘 要 2019年8月12日，经国家外来动物疫病研究中心检测，确诊新疆伊犁州发生牛结节性皮肤病疫情，这是新疆首次发现该病。疫情确诊后，对病牛所在县及其相邻县全部牛只进行紧急免疫山羊痘疫苗。为了了解免疫后抗体水平，验证检测试剂盒特异性，选取3个规模化牛场及1个规模化羊场，采用双抗原夹心酶联免疫法，对76份牛血清样本和36份羊血清样本进行了检测。结果显示，测试的双抗原ELISA检测试剂盒，可以检测到16份牛结节性皮肤病病毒感染抗体和21份山羊痘病毒免疫抗体，未能检出山羊痘免疫牛血清中相关抗体。

关键词 牛结节性皮肤病；抗体检测；免疫抗体；LSDV 特异性抗体

2019年8月3日，新疆伊犁哈萨克自治州报告在伊犁察布查尔县琼博拉镇入户排查时，发现部分牛养殖户有1-2头发病，患牛皮肤出现广泛性结节（疙瘩）、流鼻涕、流涎、食欲减退及发烧等临床症状，初步诊断为疑似牛结节性皮肤病（LSD）。疫情确诊后，采用国家批准的山羊痘疫苗（按照山羊的5倍剂量），对病牛所在县及其相邻县全部牛只进行紧急免疫。为了验证检测试剂盒特异性，选取46份LSDV感染牛血清，66份免疫血清样本（36份羊血清，30份牛血清），采用双抗原夹心酶联免疫法对血清样本进行了检测，为做好LSD防控提供一些数据支撑。

1 材料与方法

1.1 分组及样品采集

1.1.1 感染组（牛结节性皮肤病感染抗体检测）。在伊犁州霍城县某发病牛场采集感染LSDV牛血清24份，在伊犁州察县某发病牛场采集感染LSDV牛血清22份。

1.1.2 试验羊组（山羊痘免疫抗体检测）。选自新疆昌吉州奇台县某规模羊场，选取整群绵羊36只，采用皮内注射进行山羊痘疫苗第1次免疫，疫苗免疫40天后采集血样。

1.1.3 试验牛组（牛免疫山羊痘抗体检测）。选自新疆伊犁州察县1个乡镇规模化养殖场选取30头，采用皮内注射进行山羊痘疫苗（按照山羊的5倍剂量免疫）第1次免疫，疫苗免疫30天后，采集血样。

1.2 疫苗及检测试剂

疫苗来源来自政府统一招标采购的山羊痘疫苗。

诊断试剂 羊痘属抗体检测试剂盒购自法国ID.VET公司，生产批号F05。

1.3 检测方法

采用双抗原夹心酶联免疫法，以羊痘病毒纯化抗原作为包被抗原，检测牛、绵羊、山羊和其它敏感物种血清中的羊痘病毒、牛结节性皮肤病病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒抗体。

1.4 仪器设备

全波长酶标仪（Thermo）、高速自动化清洗酶标板（瑞士帝肯）、微量移液器等。

2 结果

2.1 感染组

共检测2个场点的46份牛血清样品，检出抗体阳性16份。

2.2 试验羊组

共检测1个场点的36份羊血清样品，检出抗体阳性21份。

2.3 试验牛组

共检测1个场点的30份牛血清样品，检出抗体阳性0份。

3 讨论和建议

此次牛结节性皮肤病疫情为新疆首例。通過采取“免疫+改良捕杀”的防控策略，即在伊犁地区紧急免疫山羊痘疫苗（按照山羊的5倍剂量免疫），同时采取仅对发病牛进行捕杀的政策，限制动物移动。由于天气转冷蚊虫等传播媒介减少，LSD疫情呈明显的季节性[1]。该疫情已得到有效控制。通过入户排查结合荧光PCR试验检测，未发现新增LSD病例。

本次检测用的双抗原ELISA检测试剂盒，未能检出山羊痘免疫牛只血清中相关抗体。这可能是由于山羊痘疫苗为弱毒苗，主要是细胞介导，可在短时间内发生免疫作用，但抗体产生的滴度水平低。有报道显示，首次免疫山羊痘活疫苗产生的抗体滴度不均，14-21天达到抗体水平峰值，51天左右出现免疫空挡，且免疫后期抗体滴度水平较低[2]，这与疫苗种类、畜禽机体、饲养管理等影响较大[3]。另一方面，山羊痘仅免疫牛只一次，产生抗体的滴度低，尤其是对轻度和持续期较长的LSDV感染，使用ELISA方法检测抗体水平来评价疫苗免疫效果不佳。此外，皮内操作困难，容易注入肌肉，造成免疫效果不确实或免疫失败[4]。

根据检测结果，可以检测到牛结节性皮肤病病毒感染抗体和山羊痘病毒免疫抗体，现阶段该试剂盒可作为牛结节性皮肤病发病早期的血清学诊断方法和山羊痘免疫羊后抗体的检测方法。建议首免21天后加强免疫一次，再进行抗体测定；同时采用中和试验结合临床观察结果确认评价疫苗免疫保护效果。

参考文献：

[1]袁丽萍，宋建德.2015-2016年欧洲牛结节性皮肤病流行状况分析[J].中国动物检疫，2017，34（8）：32-35.

[2]刘忠伟.山羊痘疫苗免疫保护能力试验[D].贵州：贵州大学，2006：1-70

[3]程国奎，于建文，柴绍芳。山羊痘疫苗抗体时效性研究与探索[J]. 中兽医医药杂志，2017，36（5）：56-57

[4]赵燕，柴绍芳，郭宪.山羊痘病毒的血清学检测与PCR鉴定[J].中兽医医药杂志，2018，37，（3）：63-64

第一作者：薛文（1987-），女，汉族，河南正阳，本科学历，助理兽医师，从事病毒性人兽共患病研究。

通讯作者：王文（1968-），女，农业推广研究员，从事动物疫病监测和防控技术的研究。