大蒜素对急性心肌缺血再灌注后心律失常和心功能影响的实验研究

俞飞虎 李红霞 苏斌杰 陈振云 刘祖秋 熊海刚 陈华山 周万青

急性心肌梗死是指冠状动脉狭窄所致持续性缺血缺氧而引发心肌缺血性坏死，继而出现心力衰竭、恶性心律失常甚至猝死，是临床上较为常见的急危重症[1-2]。及时恢复血流再灌注是临床上的首选治疗方案，但再灌注后所引发的室性心律失常以及心功能急剧减退是导致心源性猝死的主要原因[3]。大蒜素是一种二烯丙基三硫化物，研究发现大蒜素能够通过抑制氧化应激损伤、改善血流动力学对心肌缺血再灌注大鼠起到一定的保护作用[4-6]。但大蒜素对心肌梗死再灌注后心律失常和心功能的影响鲜有报道。维拉帕米是一种钙离子拮抗剂，能够通过抑制钙离子内流而减轻缺血再灌注损伤[7]，是临床上治疗心肌缺血再灌注损伤的常用药物，并常作为阳性对照药物用于心肌缺血再灌注损伤的动物实验研究[8]。本实验拟通过结扎冠状动脉左前降支复制大鼠心肌缺血再灌注模型，研究大蒜素对大鼠心肌缺血再灌注后心律失常和心功能的影响，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物 清洁级建康成年雄性SD 大鼠120只，体质量250～300g，购自宁波大学实验动物中心[SYXK（浙）2014-0005]，动物合格证号：20181207016。实验前清洁环境饲养1 周，光照：黑暗时间为1∶1，室温（25±1）℃，相对湿度（60±10）%。

1.2 试验药物与试剂 包括大蒜素注射液（黑龙江江世药业有限公司，规格：2ml ∶30mg，批号：20181006）；盐酸维拉帕米注射液（黑龙江多多药业有限责任公司，规格：2ml∶5mg，批号：180917）；天冬氨酸转氨酶（AST）、肌酸磷酸激酶（CPK）、乳酸脱氢酶（LDH）（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，批号：20180409、20181004、20181012）；Na+-K+-ATP酶试剂盒、Ca2+-Mg2+-ATP 酶试剂盒（上海江莱生物科技有限公司，批号：20180524、20181012）；一氧化氮合酶（NOS）、一氧化氮（NO）试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：20161229、20170316）；钙标准液（上海生物制品研究所，批号：180726）；红四氮唑（TTC）（北京化学试剂公司，批号：171209）。

1.3 实验仪器 包括DH-150 型动物呼吸机（浙江大学医学仪器有限公司）；BL-420E 型生物信号采集仪（成都泰盟科技有限公司）；Vevo770 型超高分辨率小动物超声实时分子影像系统（加拿大Visual-Sonics 公司）；BH-2 型倒置光学显微镜（日本Olympus 公司）；BS-200 型全自动生化分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；RM2125 型组织切片机（德国Leica 公司）；Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统（北京麦克奥迪仪器仪表有限公司）；DU700 型紫外-可见分光光度计（美国Beckman Coulter 公司）。

1.4 方法

1.4.1 动物分组、模型制备与给药 按照随机数字表法将120 只大鼠分为假手术组（0.9%氯化钠溶液）、模型组（0.9%氯化钠溶液）、大蒜素低[5mg/（kg·d）]、中[10mg/（kg·d）]、高[20mg/（kg·d）]剂量组和维拉帕米组[2.5mg/（kg·d）]，各20 只。参照张卫强等[9]的手术方法复制心肌缺血再灌注大鼠模型：以50mg/kg 剂量腹腔注射1.2%戊巴比妥钠溶液实施麻醉，取仰卧位，行二导联心电图实时监测，气管切开并连接动物呼吸机（参数设置：频率60 次/min、潮气量20ml/kg、呼吸比1.5∶1）；于左胸第3～4 肋骨间切开皮肤、钝性分离开胸，充分暴露心脏、剪开心包膜，于左心耳下缘约2mm 处动脉夹夹闭冠状动脉左前降支，以左心室前壁颜色呈灰白至紫绀、心电图ST段抬高或T 波高耸为造模成功标志，以20 万U/kg剂量局部给予青霉素预防感染，30min 后松开动脉夹，然后逐层缝合；假手术组除了不结扎冠状动脉左前降支外，其余操作与模型组相同。大蒜素低、中、高剂量组和维拉帕米组给药方法：各组大鼠均于术后第2 天开始腹腔注射给药，1 次/d，疗程4 周。

1.4.2 心律失常情况监测及评分 监测并记录Ⅱ导联心电图PR 间期、QRS 间期以及ST 段变化，计算室性心动过速（VT）、心室颤动（VF）发生率；依照李涛等[10]的心律失常评分标准：＜5 次室性前期收缩，计0 分；≥5 次室性期前收缩，计1 分；一阵＜60s VT，计2 分；一阵≥60s VT 或多阵VT 但累计＜60s VT，计3 分；多阵VT 累计＞60s，计4 分；出现VF，计5 分。

1.4.3 心功能监测 通过超高分辨率小动物超声实时分子影像系统进行心功能检测：取左心室乳头肌水平短轴切面，测量指标包括：左心室舒张末期内径（LVEDd）、左心室收缩末期内径（LVESd）、左心室短轴缩短率（LVFS）、左心室射血分数（LVEF）、每搏输出量（SV），均连续测量3 个心动周期后取平均值。

1.4.4 心肌组织病理学检查 采用随机数字表法在6 组大鼠中各取6 只大鼠，腹腔注射1.2%戊巴比妥钠溶液麻醉后开胸取心脏组织，切取左心室部位置4%多聚甲醛溶液继续固定72h。经固定的左心室组织进行石蜡包埋和切片，切片厚度2μm，经二甲苯透明、梯度酒精脱蜡水化处理，然后行HE 染色：苏木精溶液浸泡5min，水冲洗2 次各30s，PBS 溶液返蓝，水冲洗30s，伊红溶液浸泡30s，然后行梯度酒精脱水、二甲苯透明处理、中性树胶封片，倒置光学显微镜观察并照相保存。

1.4.5 血清心肌酶水平测定 在1.4.4 步骤取心脏前，由腹主动脉取动脉血并经1 500r/min 离心10min 后取血清，经全自动生化分析仪测定血清AST、CPK、LDH 水平。

1.4.6 心脏指数和梗死体积百分比测定 采用随机数字表法在6 组大鼠中各取6 只大鼠，麻醉后称体质量，开胸取心脏后称质量，然后计算心脏指数（心脏质量/体质量）；心脏称重后立即置于-20℃冰箱冻存0.5h，进行心脏组织切片，厚度为2mm，浸入预配置好的恒温37℃浓度1%的TTC 溶液中，避光孵育0.5h，每5min 翻动切片一次使之均匀着色。染色后灰白色为心肌梗死区、红色为正常组织，拍照后应用Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统计算切片梗死面积，脑梗死体积百分比（%）=（梗死面积×切片厚度/切片面积×切片厚度）×100%。

1.4.7 心肌生化指标测定 取各组剩余8 只大鼠，麻醉后迅速开胸取心脏组织，于冰上剪碎后置离心管并加入9 倍量RIPA 蛋白裂解液，冰水浴中研磨匀浆，低温高速离心（4℃，12 000r/min）15min 后取上清液，严格按照试剂盒说明步骤处理后，通过紫外-可见分光光度计测定Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性；通过原子吸收光度计测定心肌细胞内Ca2+浓度；采用催化L-Arg 比色法测定NOS 活性，硝酸酶还原法检测NO 含量。

1.5 统计学处理 采用SPSS15.0 统计软件，计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料以百分率表示，比较采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心电图结果比较 见表1。

表1 各组大鼠心电图结果比较

由表1 可见，与假手术组比较，模型组心电图PR 间期、QRS 间期缩短、ST 段抬高，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；与模型组比较，大蒜素中、高剂量组和维拉帕米组PR 间期、QRS 间期延长且ST段降低（P＜0.05 或0.01）；大蒜素高剂量组PR 间期、QRS 间期及ST 段高度与维拉帕米组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.2 各组大鼠心律失常情况及评分比较 见表2。

表2 各组大鼠心律失常情况及评分比较

由表2 可见，与假手术组比较，模型组VT、VF发生率及心律失常评分升高，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；与模型组比较，大蒜素中、高剂量组和维拉帕米组VT、VF 发生率降低（均P＜0.01），心律失常评分降低（P＜0.05 或0.01）；大蒜素高剂量组心律失常评分较维拉帕米组降低（P＜0.05），VT、VF 发生率差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.3 各组大鼠心功能指标比较 见表3。

表3 各组大鼠心功能指标比较

由表3 可见，与假手术组比较，模型组LVEDd、LVESd 升高，LVFS、LVEF、SV 降低，差异均有统计学意义（P＜0.05 或0.01）；与模型组比较，大蒜素高剂量组和维拉帕米组LVEDd 降低（均P＜0.05），大蒜素中、高剂量组和维拉帕米组LVESd 降低，LVFS、LVEF、SV 升高（P＜0.05 或0.01）；大蒜素高剂量组各指标与维拉帕米组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.4 各组大鼠心肌组织病理学检查结果 见插页图1。

由插页图1 可见，假手术组心肌纤维条理清晰呈束状，细胞形态规则、结构完整、排列有序；与假手术组比较，模型组呈现心肌纤维条理不清，出现断裂和紊乱，细胞数量减少、部分细胞坏死，炎性细胞浸润等病理性改变；大蒜素低、中、高剂量组和维拉帕米组较模型组心肌纤维及心肌细胞上述病变均有所减轻，其中以大蒜素高剂量组最为显著。

2.5 各组大鼠血清心肌酶水平比较 见表4。

表4 各组大鼠血清心肌酶水平比较

由表4 可见，与假手术组比较，模型组血清AST、CPK、LDH 水平升高，差异均统计学意义（均P＜0.01）；与模型组比较，大蒜素低、中、高剂量组和维拉帕米组血清LDH 水平降低（P＜0.05 或0.01），大蒜素中、高剂量组和维拉帕米组血清AST、CPK水平降低（P＜0.05 或0.01）；大蒜素高剂量组LDH水平较维拉帕米组降低（P＜0.05），AST、CPK 水平差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.6 各组大鼠心脏指数和梗死体积百分比比较见表5。

由表5 可见，与假手术组比较，模型组心脏指数和梗死体积百分比均升高，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；与模型组比较，大蒜素中、高剂量组和维拉帕米组心脏指数和梗死体积百分比均降低（P＜0.05 或0.01）；大蒜素高剂量组心脏指数、梗死体积百分比与维拉帕米组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

表5 各组大鼠心脏指数和梗死体积百分比比较

2.7 各组大鼠心肌组织Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+- ATP 酶活性及细胞内Ca2+浓度比较 见表6。

表6 各组大鼠心肌组织Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性及细胞内Ca2+浓度比较

由表6 可见，与假手术组比较，模型组Na+-K+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性降低而细胞内Ca2+浓度升高，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；与模型组比较，大蒜素中、高剂量组和维拉帕米组Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性升高且Ca2+浓度降低（P＜0.05 或0.01）；大蒜素高剂量组Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性较维拉帕米组升高（P＜0.05），Na+-K+-ATP 酶活性和Ca2+浓度差异均无统计学意义（均P＞0.05）。2.8 各组大鼠心肌组织NOS 活性及NO 含量比较见表7。

表7 各组大鼠心肌组织NOS 活性及NO 含量比较

由表7 可见，与假手术组比较，模型组NOS 活性和NO 含量均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；与模型组比较，大蒜素低中、高剂量组NOS 活性及NO 含量均升高（P＜0.05 或0.01）；大蒜素高剂量组NOS 活性和NO 含量较维拉帕米组均升高（P＜0.05 或0.01）。

3 讨论

目前，通过药物溶栓或经皮冠状动脉介入（PCI）等技术手段恢复血流再灌注、抢救缺血区心肌细胞、缩小梗死面积，仍是临床上救治急性心肌梗死患者的首选治疗方案[11]。但再灌注后所引发的恶性心律失常以及心功能急剧减退是导致心源性猝死的主要原因，这也为研发改善急性心肌梗死患者预后的新型药物提供了新的靶点。

大蒜素是一种天然存在的二烯丙基三硫化物。王瑞等[12]研究发现大蒜素能够降低高血脂症患者血脂和体重指数，张昆[13]研究发现大蒜素能够改善血流动力学和血液流变学。本实验通过复制急性心肌缺血再灌注大鼠模型并给予大蒜素进行干预治疗，发现经大蒜素治疗能够有效改善心肌缺血再灌注大鼠心电波形（PR 间期、QRS 间期延长且ST 段降低），抑制心肌组织病理学改变，减小心肌梗死体积、降低心脏指数（减轻心脏组织水肿），且高剂量大蒜素对心肌组织病变的抑制作用优于维拉帕米，提示大蒜素对心肌缺血再灌注大鼠心脏组织具有一定的保护作用。

VT 和VF 是最常见的心律失常表征。本研究经心电监测，发现经大蒜素治疗能够有效降低心肌缺血再灌注大鼠VT、VF 发生率，明显降低心律失常评分，并且大蒜素高剂量组心律失常评分显著低于维拉帕米组，提示大蒜素对大鼠心肌缺血再灌注后心律失常具有明显的抑制作用。

LVEDd、LVESd、LVFS、LVEF、SV 能够反应心脏组织功能；正常生理状态下，血清心肌酶（AST、CPK、LDH）水平极低，当心肌细胞受损后细胞内心肌酶释放入血，导致血清心肌酶水平陡增，所以血清心肌酶水平能够敏感反映心肌细胞及心功能受损程度[14]。本实验发现，经大蒜素治疗能够有效降低心肌缺血再灌注大鼠心脏LVEDd、LVESd 并升高LVFS、LVEF、SV，降低血清AST、CPK、LDH 水平，且大蒜素高剂量组降低血清LDH 作用优于维拉帕米组，提示大蒜素具有改善心肌缺血再灌注大鼠心功能的作用。

能量耗竭是心肌缺血再灌注后引发心律失常的病理机制。首先，能量代谢障碍所致ATP 合成受阻、ATP 依赖性的Ca2+-Mg2+-ATP 酶活力降低、细胞内Ca2+泵出能力下降，导致心肌细胞Ca2+超载进而引发心律失常[15-16]；其次，ATP 合成受阻将导致Na+-K+-ATP 酶活力进一步降低[17]、细胞外K+增多，导致缺血中央至边缘区K+含量逐渐下降的不均匀分布态势，这也是导致心律失常的重要原因之一。本实验研究发现，经大蒜素治疗能够明显改善急性心肌缺血再灌注大鼠心肌组织Ca2+-Mg2+-ATP 酶、Na+-K+-ATP 酶活力并降低心肌细胞Ca2+浓度，且大蒜素高剂量组对Ca2+-Mg2+-ATP 酶活力的改善作用优于维拉帕米组，这可能是大蒜素降低大鼠急性心肌缺血再灌注后心律失常发生率的重要分子机制。

NO 是体内非常重要的信号传导因子，具有扩张血管、增加冠状动脉血流量、改善缺血区血流灌注、提高心肌细胞氧供/需比等而抑制心律失常发作的生理作用[18]；而NOS 是体内促NO 生成的关键酶。本研究发现，经大蒜素治疗能够有效改善急性心肌缺血再灌注大鼠心肌细胞NOS 活性并提高NO含量，这可能也是大蒜素抑制心肌缺血再灌注后心律失常的重要分子机制之一。

综上所述，大蒜素对大鼠急性心肌缺血再灌注后心律失常和心功能均具有明显的改善作用，其作用机制可能与大蒜素改善心肌组织Ca2+-Mg2+-ATP酶和Na+-K+-ATP 酶活力、降低心肌细胞Ca2+浓度、提高NO 含量有关。