智三针电针改善血管性痴呆大鼠认知功能及机制

朱世 唐中生 胡雪梅 魏宇唯 林吉

(1贵州中医药大学解剖教研室，贵州 贵阳 550025；2贵州中医药大学研究生院)

血管性痴呆(VD)是老年人常见的痴呆类型之一，严重损害中老年人的健康，在早期阶段有效防治VD具有重大的社会意义〔1〕。在哺乳动物神经系统发育过程中，Eph受体及其配体ephrin在突触特异性连接的建立过程及可塑性的调节等方面都有重要作用〔2〕，进而影响到大脑的学习与记忆功能〔3〕。智三针电针疗法对VD有积极的预防和治疗作用。本文通过研究Eph/ephrin对突触棘形态结构可塑性的调控，探讨智三针电针对VD大鼠学习记忆改善的主要机制，为临床电针治疗VD提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性SD大鼠60只，体重300～320 g，由第二军医大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(军)2012-0011。

1.2器材 手术器械1套，华佗牌针灸针(0.3 mm×40 mm，苏州医疗用品厂)。石蜡组织包埋机(德国Lica公司，EG1140)；石蜡组织切片机(德国Lica公司，RM2145)；BX51型光学显微镜(日本Olympus)；高速冷冻离心机(湘仪贝克)；Morris水迷宫(江苏赛昂斯公司)；微型动脉夹、加热式单极电凝针(杭州康生医疗)等。

1.3药品与试剂 戊巴比妥钠(P3761，Sigma)；尼莫地平片(亚宝药业公司，国药准字H14022821)；4%多聚甲醛，蛋白酶抑制剂、蛋白定量试剂盒(赛默飞，货号23246)、一步法快速Western印迹试剂盒(兔、鼠)、ECL发光检测试剂盒、β-actin抗鼠单克隆抗体(北京康为世纪)；ephrinB3、EphA4、ephrinA3、EphB2(博奥森)，干扰素(IFN)-γ、C1q试剂盒(Elabscience)。组织包埋盒(江苏世泰实验器材公司，31050102W)。

1.4分组 将动物随机分为假手术组、VD 模型组、尼莫地平组和电针组，剔除造模过程中死亡的大鼠，保证每组12 只。

1.5动物模型的建立 采用改良四血管阻断法(4-VO)模拟大鼠VD模型〔4，5〕。采用3%戊巴比妥钠(1 ml/100 g)腹腔麻醉，电凝针灼烧凝闭双侧椎动脉，动脉夹反复夹闭颈总动脉〔5，6〕。将造模成功的大鼠按照前期课题组的设计随机分为VD 模型组、电针组和尼莫地平组。设置假手术组作为阴性对照，排除手术对实验的干扰，该组不进行血管的灼闭和夹闭。术后各组腹腔注射青霉素预防感染。

1.6治疗方法 术后7 d，待伤口完全愈合、饮食正常，给予相应治疗。电针及尼莫地平组每天治疗1 次，7 d为1个疗程，共治疗3个疗程，疗程之间休息1 d。电针组，术后第7天开始治疗。采用特制的固定器固定大鼠头部及四肢，保持其清醒状态下，定位大鼠的本神穴及神庭穴〔6〕，施以60 Hz的连续波，电针治疗20 min。尼莫地平组，根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”确定大鼠灌胃药量，按12 mg/(kg·d)的用量、3 mg/ml的浓度配制，进行灌胃治疗。

1.7Morris水迷宫检测行为认知功能 治疗结束后开始水迷宫测试。第1～6天进行路线学习实验，以迷宫四周的标志为参照物，引导大鼠记忆入水点到平台的路线，如在2 min内未找到平台，引导大鼠站在平台上记忆参照物及路线，记录找到平台所用时间，如未在规定时间内找到平台，时间记为120 s。第7天进行路线记忆实验：记录2 min内大鼠在平台所在象限搜索平台所用的时间百分比。

1.8脑组织HE染色〔7〕采用3%戊巴比妥钠(1 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，先后灌注生理盐水和多聚甲醛〔5〕，灌注结束后置于4%多聚甲醛中固定。取大鼠海马CA1区，HE染色，光镜下观察脑组织细胞变化。

1.9血浆炎症因子测定 用3%戊巴比妥钠(1 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，股动脉取血，3 000 r/min离心20 min取上清，按照试剂盒说明书检测IFN-γ、C1q含量。

1.10Western印迹检测 称取大鼠海马脑组织，尽可能剪碎，先将蛋白抽提试剂进行预冷，加入蛋白酶抑制剂、组织蛋白抽提试剂，冰浴匀浆及超声破碎；离心收集上清；30%Acr-Bis分离胶缓冲液，10%APS TEMED混匀，制备10%分离胶，上样，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，20 mA恒流电泳，待预染Marker条带分离清晰、间距适宜时，停止电泳。200 mA恒流，低温转膜2 h。转膜结束，使用一步法快速Western印迹试剂盒(康为世纪鼠CW2030，兔CW2029)，加入封闭液中，20 min；另取二抗HRP至4 ml离心管中，再取一抗与二抗混匀，室温孵育5 min，加入一步法抗体稀释液。在反应盒内加入高灵敏度化学发光检测试剂盒A液及B液各1 ml，混匀，放入聚偏氟乙烯(PVDF)膜，扫面胶片，定量分析。

1.11统计学方法 采用SPSS19.0软件行t检验。

2 结 果

2.1各组空间学习能力比较 随着训练引导天数增加，VD模型组寻找平台所用时间比假手术组明显延长(P<0.05)，证明VD模型组的学习能力低于假手术组，造模有效。电针组和尼莫地平组寻找平台所用时间比VD模型组明显缩短(P<0.05)，证明智三针电针和尼莫地平都能提高血VD大鼠学习能力。电针组与尼莫地平组比较差异无统计学意义(P>0.05)

2.2各组空间记忆能力比较 第7天，VD模型组平台象限搜索的时间百分比明显低于假手术组，说明VD组记忆能力下降；电针组和尼莫地平组搜索平台象限概率显著高于模型组，说明电针治疗和尼莫地平都能提高VD大鼠的空间记忆能力，但电针组与尼莫地平组比较搜索时间百分比及搜索次数差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3各组海马CA1区组织形态学观察 HE染色后，低倍镜下假手术组大鼠海马CA1区神经元细胞排列整密无缺失；VD模型组神经细胞各层界限不十分清晰，细胞出现缺失现象。高倍镜下，假手术组星形细胞和锥体细胞形态较为清楚，细胞带排列基本致密完整；VD模型组细胞排列无序杂乱，核固缩深染，多数细胞溶解坏死，未见细胞带；电针组和尼莫地平组较VD模型组变性坏死细胞明显减少。提示与假手术组相比，VD模型组海马区病变损伤程度最严重，而电针组病变损伤程度明显减轻，说明电针智三针处理对VD大鼠海马区缺血性损伤有较好的改善作用，尼莫地平组与电针组差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.4针刺能改善VD大鼠大脑炎症反应 VD组血清IFN-γ和C1q含量均明显高于假手术组，电针组血清IFN-γ和C1q含量明显小于VD模型组。提示造模后的大鼠脑缺血会产生全身性的炎症反应，而智三针电针治疗可以减轻VD大鼠脑缺血后的炎症反应。电针组与尼莫地平组差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

图1 各组大鼠海马CA1区病理改变(HE)

表1 各组血清IFN-γ和C1q含量比较

与假手术组比较：1)P<0.05；与VD模型组比较：2)P<0.05；与尼莫地平组比较：3)P<0.05；下表同

2.5Eph/ephrin信号通路调控突触可塑性 与假手术组比较，VD模型组海马区突触膜表面EphB2和ephrinB3的表达明显提高(P<0.05)；与VD模型组比较，电针组海马区突触膜表面EphB2和ephrinB3的表达明显提高(P<0.05)。尼莫地平组与电针组比较无统计学差异(P>0.05)。见图2，表2。

图2 各组脑组织海马区EphB2、ephrinB3表达

组别EphB2ephrinB3假手术组0.147±0.0180.212±0.021VD模型组0.052±0.0191)0.120±0.0211)尼莫地平组0.352±0.0231)2)0.377±0.0311)2)电针组0.383±0.0031)2)3)0.358±0.1061)2)3)

3 讨 论

脑血管疾病严重威胁着人类的健康，尤其是缺血性脑血管病发病率逐年增高。VD是目前痴呆和脑缺血领域研究的一个热点。“智三针”为“靳三针”之一，是我国针灸大师靳瑞独创的治疗老年性痴呆、VD、健忘等有关智力与记忆方面疾病的经典组穴，在临床上取得了良好的治疗效果〔8〕。智三针所取三穴，为神庭穴与两侧的本神穴。本实验采用的4-VO模拟的VD大鼠模型，实际上是大脑的缺血再灌注模型〔9〕。大鼠大脑缺血再灌注的过程导致了海马区神经元坏死和凋亡，进而导致大鼠的学习和记忆能力低下。同时缺血再灌注过程会产生大量的炎症因子和补体人血〔10〕。血中的炎症因子和补体相关因子会加重缺血后的脑组织损伤〔11〕。本实验结果证实炎症反应参与了脑缺血继发性损伤的过程。证明智三针电针治疗减轻了脑缺血后的炎症反应和再灌注对脑组织的损伤。

突触前膜的EphB2和突触后膜的ephrin B3之间的相互作用抑制了MAPK信号，使效应蛋白的生物学效应降低，从而影响突触功能的可塑性〔12，13〕。活化的EphB2能够黏着斑激酶(FAK)与细胞骨架相关蛋白Rho A活化，进而调控树突棘形态结构的可塑性〔14，15〕。本研究提示智三针电针和尼莫地平均能调节突触功能的可塑性，提高树突棘的形成和促进突触功能的成熟，有利于改善VD大鼠的学习和记忆能力。造模后大鼠的学习记忆能力显著下降，伴随大脑缺血缺氧及海马区大量神经元细胞凋亡；智三针电针改善了大脑缺血、海马神经元细胞凋亡和脑缺血再灌注后的炎症反应，提高了大鼠学习及记忆能力，其机制可能是通过调节突触前膜EphB2和突触后膜ephrinB3表达，降低血清IFN-γ和补体Gq表达来实现。