蛭弧菌CS258的分离鉴定及裂解特性

2019-12-09葛宝霖史学华徐晨潇

安徽农学通报 2019年21期

葛宝霖史学华徐晨潇

摘要：以大肠杆菌为宿主，从养殖水中分离得到5株蛭弧菌菌株，对其中裂解效果最好的蛭弧菌CS258进行进一步研究。结果表明，蛭弧菌CS258的最适生长温度为30℃，最适pH为7.5。蛭弧菌CS258作为一种“活的抗生素”，具有很大的发展空间和应用价值。

关键词：蛭弧菌;裂解特性;分离;鉴定

中图分类号 Q939文献标识码 A文章编号 1007-7731（2019）21-0040-03

Abstract：In this project，five Bdellovibrio-and-like organisms （BALOs） were isolated from6 strains of bacteria were isolated from water samples from breeding pond using bacterium Escherichia coli as the host. Strain CS258 with the best lysing characteristic was selected further studied. The results showed that the optimal growth temperature of strain CS258 was 30℃，and the optimum pH is 7.5.The research results show that CS258 as a "living antibiotic" has a strong development space and application value.

Key words：Bdellovibrio;Lysing Characteristics;Isolation;Identification

1962年Stolp[1]等人首次从菜豆叶烧病假单胞菌中分离获得蛭弧菌，由此人们开始对蛭弧菌展开研究。研究发现，蛭弧菌是一类寄生性的革兰氏阴性细菌[2]，可以进攻其它细菌进而使自身获得营养进行增殖，并能导致宿主菌的裂解[3]。蛭弧菌的个体比较小，大小一般为0.3～0.6×0.8～1.2μm，且能通过细菌滤器，一端具有鞭毛，一般呈弧状或者杆状[4]。因为蛭弧菌不能侵染真核细胞[5]，因此其对生物的无毒害性使得它成为了养殖业、食品保鲜业、农业等领域的抢手品。

近几年来，越来越多的学者致力于对蛭弧菌的研究开发中，包括我国“蛭弧菌第一人”秦生巨[6]、孙秋平[7]等人均对蛭弧菌的发展贡献了自己的力量。本实验选取养殖水中分离得到的1株蛭弧菌，从温度、pH值等方面研究其最适生长条件，为蛭弧菌的长期培养、在水产养殖等方面应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源蛭弧菌分离自养殖水中;宿主株（大肠杆菌）为实验室分离并保藏。

1.1.2 试剂酵母膏、蛋白胨、琼脂粉、氯化钠、氢氧化钠、盐酸、自来水、蒸馏水等。

1.1.3 培养基的配制 LB液体培养基：蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠10g、自来水1000mL，用2mol/L的NaOH溶液调节pH至7.2～7.5。在102.9kPa高壓、121℃下蒸汽灭菌20min后备用。双琼脂培养基：上层0.7%琼脂培养基（自来水1000mL、琼脂7g）;下层1.75%琼脂培养基（自来水1000mL、琼脂17.5g）。上、下层培养基均调节pH至7.0～7.5，在102.9kPa高压、121℃下蒸汽灭菌20min后备用。

1.1.4 仪器和设备电子天平、pH计、恒温振荡器、高温高压蒸汽灭菌锅、双人单面净化工作台、生化培养箱、数显恒温水浴锅、台式高速冷冻离心机、冰箱、移液枪、微波炉、pH试纸、酒精灯、培养皿、锥形瓶、试管、试管架、量筒、玻璃棒、烧杯等。

1.2 实验方法

1.2.1 （宿主）大肠杆菌菌悬液的制备实验前1d，从大肠杆菌固体培养基上挑取分离纯化后的单菌落接种至含5mLLB培养基的试管中，37℃振荡培养10～12h，确保大肠杆菌的活力。

1.2.2 蛭弧菌的分离纯化采用双层琼脂平板法[8]分离蛭弧菌，将已灭菌的下层1.75%琼脂培养基倒平板备用;将取得的养殖水在转速为1000rpm、温度为4℃的条件下离心5min，备用;将0.3mL宿主大肠杆菌、0.5mL离心后的养殖水上清液和7mL上层0.7%琼脂培养基充分混匀，倒入已凝固的下层培养基中，凝固后于在28℃恒温培养箱中倒置放培养3～6d，定期观察噬菌斑出现的情况。用单斑传代法[9]，从双层琼脂平板上挑取1个直径较大的噬菌斑，置于含有浸出液的试管中，放在28℃、150rpm的恒温摇床上培养5h，代替养殖水，重复多次分离的步骤，直至平板上出现形态一致且无杂菌的噬菌斑。

1.2.3 蛭弧菌菌液的制备将用1.2.2中分离获得的蛭弧菌，用接种环接种于200μL无菌水中，无菌水变浑浊时即为蛭弧菌菌液，置于4℃保存备用。

1.2.4 噬菌斑形态观察本实验以大肠杆菌为宿主菌，采用的是双层琼脂平板法。经过60h培养后观察其形成的噬菌斑的形态和大小。

1.2.5 液体培养鉴定待宿主大肠杆菌固体培养长出菌落后，挑取其菌落并加入灭菌蒸馏水5mL制成宿主菌悬液，取30mL含有203.3mg/L MgCl2·H2O、3.94mg/L CaCl2·H2O的无菌水置于三角瓶中。加入宿主菌悬液0.5mL，再从双层平板上挑取单个噬菌斑置于三角瓶中。在28℃下震荡培养48h观察溶液是否由混浊变为澄清[10]。

1.2.6 过氧化氢酶鉴定从双层平板上挑取单个噬菌斑置在干净的载玻片上，滴加1滴3%过氧化氢溶液观察0.5min内是否有气泡产生，能产生气泡的为阳性，不产生气泡的为阴性

1.2.7 温度对CS258菌株生长的影响设置5个温度梯度，分别为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃。将5mL 的大肠杆菌菌悬液和5mL的噬菌斑浸出液加入到装有90mL的无菌自来水三角瓶中充分混匀，将三角瓶放在恒温摇床中，根据5个温度梯度进行实验，每个温度组设置3个重复。培养2d后，再采用双层平板法培养，每隔12h观察1次，对每个温度梯度下的培养物采取噬菌斑计数，观察温度对CS258菌株裂解特性的影响。

1.2.8 pH对CS258菌株生长的影响设置5个pH梯度，分别为6、6.5、7、7.5、8。将5mL的大肠杆菌菌悬液和5mL的噬菌斑浸出液加入到装有90mL的无菌自来水三角瓶中充分混匀。用稀HCl和稀NaOH溶液调节培养物的pH 值。每个pH设置3个重复组。将三角瓶放在30℃的恒温摇床中，培养2d后，倒入双层平板中，每隔12h观察1次，对每个pH梯度下的培养物采取噬菌斑计数，观察pH对CS258菌株生长的影响。

1.2.9 NaCl浓度对CS258菌株生长的影响设置5个NaCl浓度梯度，分别为0.25%、1%、2%、3%、4%，对照组不加NaCl，将5mL的大肠杆菌菌悬液和5mL的噬菌斑浸出液加入到装有90mL的无菌自来水三角瓶中充分混匀。每个浓度梯度设置3个重复组。将三角瓶放在30℃的恒温摇床中，培养2d后，倒入双层平板中，每隔12h观察1次，对每个浓度梯度下的培养物采取噬菌斑计数，观察Na2+对CS258菌株生长的影响。

2 结果与分析

2.1 CS258菌株的分离本实验以大肠杆菌为宿主菌，采用双层琼脂平板法，根据噬菌斑的形态和大小，共从养殖水中分离出5株裂解宿主菌的蛭弧菌菌株，选取裂解特性最强的蛭弧菌CS258为进一步研究的对象。此菌株在48h后开始出现噬菌斑，首先表现为点状，随着时间延长噬菌斑逐渐扩大，培养96h后，噬菌斑的直径约为2.0～4.0mm，形状为圆形透明，边缘整齐（见图1）。

2.2 噬菌斑的鉴定

2.2.1 噬菌斑形态以大肠杆菌为宿主，采用双层琼脂平板法，培养60h后，得到肉眼可见的透明圆斑，其平均直径在1mm左右、形状为圆形透明、边缘整齐。形成的噬菌斑见图1。

2.2.2 过氧化氢酶鉴定从平板上挑取的单个噬菌斑，滴加了1滴3%过氧化氢溶液，30s后无气泡产生（图1）。

2.2.3 液体培养鉴定在含有203.3mg/LMgCl2·H2O、3.94mg/LCaCl2·H2O的无菌水中加入0.5mL的宿主菌悬液，并挑取单个噬菌斑置于溶液中，在28℃下恒温震荡24h，24h后，溶液由浑浊变为透明（图1）。

2.3 影响CS258菌株生长的因子

2.3.1 温度由表1可知，不同温度条件对CS258菌株的生长有着很显著的影响。该CS258菌株在25～40℃下培养3d～5d后，在双层平板上都可以正常生长，但温度在高于45℃时则不能正常生长，CS258菌株在25℃下裂解效果比在30℃～40℃下差，形成的噬菌斑也小于后者形成的噬菌斑。结果说明，该CS258菌株属于嗜中高温性细菌。

2.3.2 pH值由表2可知，该CS258菌株对pH适应范围较广，从pH6.0～8.0范围内蛭弧菌均能发挥裂解特性。当pH为6时，蛭弧菌CS258裂解宿主大肠杆菌需要64h，而且形成的噬菌斑数量少、不清晰。随着pH的增大，出斑时间都稳定在53h左右，CS258菌株噬菌斑的量在pH值7.5时达到最大，当pH在8时，形成的噬菌斑明显减少。结果说明，该CS258菌株更适宜在弱碱的环境下生长。

2.3.3 NaCl 结果表明，CS258菌株的生长与NaCl浓度有关。当NaCl浓度较低时，菌株CS258生长速度快，形成噬菌斑的时间短，形成的噬菌斑透明程度高;在NaCl浓度高时，CS258菌株的数量下降，形成噬菌斑所需时间长，总的数量也少。结果说明，该CS258菌株适合在低浓度的NaCl浓度环境下生长。

3 结论与讨论

本实验从养殖水中取得含有蛭弧菌的水样，经过初步筛选，从中分离得到了1株蛭弧菌CS258。蛭弧菌CS258菌株在温度25℃～40℃范围下都能生长，最适宜的生长温度在30℃左右;pH在6～8范围内可以生长，最适合的pH值为7.5左右。马兰[11]等人的研究表明蛭弧菌的最适生长pH为8，最适生长温度为35℃。彭宗辉[12]等人从深圳湾海泥中分离出的2株蛭弧菌，最适生长pH均为7.2，最适生长温度分别为25℃和30℃。本研究与这些研究的蛭弧菌生长条件有些差异，这主要是由于不同的蛭弧菌菌株间的差异所致。

蛭弧菌可以裂解治病菌，这一特性特性使其在水产养殖[13-14]、家禽养殖[15]、净化养殖水体[16-17]、食品安全[18]和医疗方面有很大的利用价值。但蛭弧菌在生物防治应用中仍然有很多问题需要解决。一是蛭弧菌的培养时间需要1周左右，培养周期相对较长。如何进一步缩短培养时间，并且进一步提高蛭弧菌的裂解活性，是急需要解决的问题。二是培养基的选择相对单一，蛭弧菌的培养多采用的是双层平板法，培养比较复杂。如何简化培养条件是当今亟待解决的另一重要问题。三是蛭弧菌培养过程中的污染问题。由于其培养周期較长，如何在大批量培养和应用中有效避免蛭弧菌受到其他杂菌的污染，也需要解决。四是产品的安全性问题。目前，蛭弧菌对人体和动物都是无害，但是在今后更加广泛的研究过程中，蛭弧菌究竟对人体是否完全没有毒害作用还需要更多的实验数据来支持。因此，广泛的应用还需要做大量的基础实验。

参考文献

[1]Giaquinta R T. Phloem Loading of Sucrose[J]. Annual Review of Plant Physiology & Plant Molecular Biology，2003，34（34）：347-387.

[2]孙秋平.蛭弧菌的分离纯化及保质期的研究[D].广州：华南理工大学，2014.

[3]马辉.噬菌蛭弧菌的特性、作用机理及应用[J].中国水产，2007，375（2）：91-92.

[4]朱乾根.天气学原理和方法[M].北京：气象出版社，2007.

[5]Skjermo J，Vadstein O. Characterization of the bacterial flora of mass cultivated Brachionus plicatilis[M].Rotifer Symposium VI. Springer Netherlands，1993.

[6]吴群凤，秦生巨.中国蛭弧菌第一人[J].当代水产，2013（9）：36-40.

[7]孙秋平，蔡俊鹏.高浓度蛭弧菌的发酵制备及其在预防羊乳腺炎中的应用[J].黑龙江畜牧兽医，2013（21）：22-25.

[8]谢群英，房文红，乔振国.海水蛭弧菌分离纯化方法初步研究[J].海洋渔业，2006，28（3）：211-216.

[9]李丽.淡水源蛭弧菌的分离、鉴定与裂解特性研究[D].上海：上海海洋大学，2013.

[10]温崇庆，薛明，周世宁.四个类群海洋蛭弧菌类生物生长特性的比较[J].微生物学通报，2009，36（6）：815-820.

[11]马兰，赵博涵，谭天宇，等.蛭弧菌裂解泛耐药革兰氏阴性菌及培养条件研究[J].四川大学学报（自然科学版），2015，52（4）.

[12]彭宗辉，蔡俊鹏，吴冰，等.两株海洋蛭弧菌的分离及生物学性质[J].微生物学报，2008，48（11）：1425-1431.

[13]许少丹.噬菌蛭弧菌应用研究进展[J].现代农业科技，2012（6）：330-332.

[14]沈勤，谢荣林，吕伟清，等.噬菌蛭弧菌在水产养殖中的应用及展望[J].河北渔业，2008，（10）：1-4.

[15]楊先乐，曹海鹏，钱云云.噬菌蛭弧菌--水产动物病害生物防治的新工具[J].淡水渔业，2006，36（2）：55-60.

[16]李怡，曹海鹏，陈水祥，等.噬菌蛭弧菌对乌鳢养殖水质的影响[J].渔业现代化，2008，（2）：11-14.

[17]张梁，沈建忠，陈佳毅.噬菌蛭弧菌对草鱼池水质及细菌群落的影响[J].水生态学杂志，2009，2（1）：6-10.