孕中期血性羊水细胞改良培养法质量分析

陈俭辉 赵连芳 景亚玲 李晓红

【摘要】 目的：探索孕中期血性羊水细胞高效的培养方法。方法：采用普通培养瓶法对46例血性羊水细胞进行培养，并对培养情况进行质量分析。结果：46例血性羊水中45例一次培养成功，1例严重新鲜血性羊水培养失败，培养成功率为97.8%。结论：提高羊水细胞培养成功率，优化血性羊水的培养及收获条件，能够为临床提供准确的产前诊断报告，对指导优生优育、预防出生缺陷具有重要意义。

【关键词】 血性羊水;产前诊断;质量控制

我国是出生缺陷大国，由于人口基数大，每年都有80～120万出生缺陷儿降生，目前没有特异性的治疗手段，只有通过实时的产前诊断和出生干预才能做到出生缺陷防控[1]。染色体病是出生缺陷最常见的原因，当前诊断的金标准就是染色体核型分析。血性羊水标本会严重影响羊水细胞的培养，所以提高血性羊水的培养成功率能有效地减轻孕妇重新穿刺的痛苦，也能提高产前诊断效率。本研究通过对46例血性羊水标本培养方法进行改良研究，提高了血性羊水的培养成功率。

1资料与方法

1.1研究资料

2017年1月至2018年12月，在本院产前诊断中心咨询，因有各种高危产前诊断指征接受羊水穿刺的46例血性羊水孕妇，孕妇孕周17～25周。

1.2方法

1.2.1标本收集穿刺孕妇在了解羊水穿刺风险和相关注意事项后，签署知情同意书，完成穿刺前检查血常规、凝血功能、血型、乙肝、丙肝、梅毒、艾滋等。B超下观察胎盘位置，羊水量及深度，确定穿刺部位，并做好记录，无菌条件下穿刺取羊水细胞20mL，记录羊水性状（颜色、浑浊度等）分装2瓶，送实验室。穿刺术后孕妇留院观察30min，无异常反应并告知术后注意事项后离院。

1.2.2培养新鲜血性羊水应及时送往实验室，离心，去上清，剩约1.0～1.5mL，重悬细胞沉淀，接种到25cm2培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养7d，换液处理，在原培养瓶加入2mL新鲜培养液培养加入新鲜羊水培养液2mL。同时将培养瓶中上清倒入新的标记培养瓶中，加入2mL新鲜培养液继续静置培养7d后观察。对于克隆岛较少的样本，在无菌条件下，先将上清进行换液处理，再用细胞刮刮取贴壁细胞，然后加入新鲜培养液培养。继续培养1～2d后观察。换液后每天观察细胞生长情况，当羊水细胞贴壁生

作者简介：陈俭辉（1988-），男，硕士，临床检验师。研究方向：产前诊断与遗传病诊断

*赵连芳为本文通讯作者

长旺盛，镜下见多个克隆和适量圆形、双圆形透明细胞时可收获。收获前1d换1次新鲜培养液，使细胞营养充足。加入浓度20μg/mL的秋水仙素100μL，混匀，继续培养4h后制备。

1.2.3制备将培养液转移到15mL的离心管中。用细胞刮刮取收集羊水细胞，再用0.9%的氯化钠溶液清洗1～2次，并转移到离心管中。1600r离心10 min，弃上清。加入0.075mol/L KCL溶液8mL，混匀，37℃低渗8min。然后加入固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）2mL，混匀预固定5min，1600r离心10min，弃上清。再加入固定液8mL，混匀，固定，1600r离心10min。重复固定1次。离心后根据细胞沉淀量加入新鲜固定液调悬，然后在25℃、55%湿度环境将细胞悬液滴于干净的玻片上，放置30min。置60℃烤箱2h。

1.2.4G显带配置0.025%胰酶溶液，37℃水浴30min后，消化染色体片（不同季节试片后确定消化时间）。0.9%的氯化钠溶液内漂洗后Giemsa染色，风干。

1.2.5核型分析将显带染色体片置于全自动扫描仪下扫描，统计中期数目。每例计数30个分裂相，分析5～10个核型。嵌合型核型加倍分析。根据《人类细胞遗传学国际命名体制》（ISCN2013）的标准描述染色体异常核型。

1.3统计学分析

采用统计软件SPSS 13.0对数据进行分析，克隆数等计数资料以率表示。

2结果

2.1羊水细胞培养成功率

46例血性羊水中35例为新鲜血性，样本占76.09%，11例为陳旧血性，样本占23.91%。45例一次培养成功，1例严重新鲜血性羊水培养失败，总成功率为97.8%（45/46）。

2.2培养细胞克隆数例

初次培养新鲜血性羊水长势较差，细胞克隆数较少;陈旧血性羊水长势相对较好，克隆数稍多。换液转种培养后出现相反的趋势，新鲜血性羊水克隆数稍丰富，陈旧血性羊水克隆数稍少。生长克隆数如表1所示。

3讨论

羊水穿刺染色体核型分析是目前染色体病诊断的金标准，但是一种创伤性的诊断方法，穿刺经过胎盘，就容易使羊水受到血细胞的污染[23]，大量的血细胞容易包裹羊水细胞，使羊水细胞不易聚集贴壁生长[4]，所以建立血性羊水细胞的培养和收获标准也是诊断所需。

首先，对于新鲜血性羊水在采集到样本后，一定要及时送往实验室离心，避免血液凝集过程中将活性羊水细胞包裹，如发现血液污染严重，可以加入1滴无菌肝素溶液，轻轻混匀。羊水接种培养7d后，观察生长情况，对于严重血性羊水进行半量换液，其他样本均全量换液，所有换出来的液体转移到新的培养瓶中加入新鲜培养液继续培养。细胞克隆丰富的样本只需加入新鲜培养液培养，待处于分裂旺盛期时加入秋水仙素收获。对于克隆岛较少的样本，换液后进行传代培养。由于胰酶的消化时间不容易把握，且影响细胞的贴壁生长，采用细胞刮轻轻刮取贴壁生长细胞[5]，然后加入新鲜培养液培养2d后，会有大量小的细胞克隆，然后换液处理，加速细胞生长，则能收获到大量羊水细胞。实验中发现新鲜血液羊水换液培养的长势比初次培养较好，可能是因为红细胞活性的降低和凝血因子等物质活性下降，抑制作用降低，羊水细胞能够进行贴壁生长所致[67]。

陈旧血性羊水主要是孕妇在穿刺之前出现过出血状况，污染了羊水，经过一段时间的吸收后会呈现出棕色或褐色，离心后能看到褐色红细胞[8]。通过实验处理来看，陈旧血性羊水对羊水细胞的贴壁生长影响稍小，初次培养后，羊水克隆普遍多于新鲜血性羊水，可能是因为凝血因子等物质活性下降的原因。而再次培养时长势稍差，可能是因为初次培养活性细胞贴壁生长，上清活性细胞少。

羊水培养染色体核型分析是一个相对较为繁琐的实验，每个实验步骤都可能影响最终的结果[9]。而血性羊水的处理会比常规处理更为繁琐，培养时与环境交流更多，所以严格控制实验的无菌操作也是保证成功的前提，把握实验过程中的质量控制，合理完善操作规程以及优化的实验条件是制作出高质量的染色体片的保证，才能为临床提供准确的分析结果[10]。

綜上所述，改良的血性羊水培养方法和羊水细胞收获流程，能够有效地提高血性羊水的培养成功率，能够避免孕妇二次穿刺的痛苦，具有较强的实际应用价值。

参考文献

[1] 魏萍，李运星，曾兰，等.9201例羊水细胞的染色体核型分析[J].中国妇幼保健，2016，31（02）：307309.

[2] 曾艳，范佳鸣，张丽芳，等.产前诊断中羊水性状对羊水细胞培养的影响[J].中华妇产科杂志，2016，51（10）：779.

[3] 李付广，汤素环，谢小雷，等.两种方法在妊娠中晚期染色体产前诊断中的应用分析[J].中国优生与遗传杂志，2018，26（02）：6264.

[4] 陈杏园，韦小妮，陆碧玉，等.5675例产前诊断胎儿细胞染色体核型分析[J].中国优生与遗传杂志，2017（11）：6769.

[5] 郑文婷，尹志军，梁映亮，等.细胞刮刮细胞法和胰酶消化法在羊水培养中的效果比较[J].检验医学与临床，2017，14（11）：16531655.

[6] 陈瑾，韩磊，张兰梅.凝血系统改变与妊娠并发症的研究进展[J].中国计划生育和妇产科，2017，09（06）：1822.

[7] Hell L，Wisgrill L，Ay C，et al.Procoagulant extracellular vesicles in amniotic fluid[J].Translational Research the Journal of Laboratory & Clinical Medicine，2017，（184）：1220.

[8] 郑娇，李春艳，程璐，等.优化的羊水细胞培养方法以及培养结果分析[J].中国产前诊断杂志（电子版），2017，09（04）：2831.

[9] 赵连芳，陈俭辉，赵咏梅，等.1543例孕中期羊水细胞染色体核型与高危产前诊断指征相关性分析[J].解放军医学院学报，2018，39（09）：756759，768.

[10]金克勤，程妙鸳，沈双双.2605份孕中期羊水细胞染色体核型分析[J].中华医学遗传学杂志，2017，34（02）：307309.